[发明专利]一种抗性HPPD基因的克隆表达的方法

权利要求书

1.抗性HPPD基因的克隆表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：对表层土壤和下水道污泥的进行采样得到样品，称取2.0g样品加入到添加有2000μmol/L硝磺草酮的50mLMSM培养基中，在30℃，180r/m富集培养5d，得到培养物；

步骤二：采用SDS-高盐法提取抗性菌株基因组DNA，根据16SrRNA基因通用引物27F/1492R中进行序列比对，下载同源性高的模式菌株的16SrRNA基因序列，在MEGA6.0软件中，利用邻接法构建进化树；

步骤三：根据同属的StenotrophomonasindicatrixWS40T的hppd基因序列，设计引物对Sthppd-F/Sthppd-R，以菌株MST-5基因组DNA为模板，PCR扩增Sthppd基因，并克隆到pMD18-T载体上，然后转化至E.coliDH5a中，提取阳性克隆子的质粒并对Sthppd基因进行测序，通过NCBI数据库中BLASTN和BLASTP对获得的Sthppd基因序列进行核酸和蛋白序列的比对分析；

步骤四：最后再进行克隆表达处理。

2.根据权利要求1所述的抗性HPPD基因的克隆表达的方法，其特征在于，所述根据16SrRNA基因通用引物27F/1492R的具体操作为：PCR扩增抗性菌株的16SrRNA基因序列，PCR产物TA克隆至pMD18-T载体，转化至EscherichiacoliDH5a，提取阳性克隆子质粒并委托上海生工进行测序，得到的抗性菌株的16SrRNA基因序列提交到在线网站EzBioCloud上。

3.根据权利要求1所述的抗性HPPD基因的克隆表达的方法，其特征在于，所述抗性菌株克隆表达的具体步骤为：在Stenotrophomonasindicatrix WS40T氨基酸序列文库中，通过同源序列比对找到其HPPD以及对应的hppd基因，并以此设计引物对Sthppd-F和Sthppd-R，以菌株MST-5基因组DNA为模板，利用PCR成功扩增出了hppd基因，命名为Sthppd，经测序，Sthppd长为1071bp，GC含量为62％，编码356个氨基酸。