[发明专利]一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用

说明书

一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用，它涉及生物检测领域，本发明有效地感知细胞内铜的变化，为筛选铜靶向药物和研究铜相关细胞生理病理机制提供帮助。本发明的检测系统是由金属硫蛋白的MT1F与EGFP结合形成的检测系统；所述的MT1F为启动子与EGFP结合，其中，MT1F启动子的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。本发明的P_MT1F‑EGFP报告系统能有效地感知细胞内铜的改变，可作为筛选铜靶向药物和研究铜相关细胞生理病理机制的工具。本发明应用于生物领域。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统及应用。

背景技术

铜离子是生物体中不可或缺的微量元素之一。它以Cu(I)和Cu(II)的形式存在于生物中。由于其具有氧化还原特性，铜离子可以用作许多酶的辅助因子，并在与酶结合后参与一些重要的生命活动。结缔组织的形成，抗氧化作用，细胞呼吸作用，神经信号传导以及细胞外基质的成熟都与铜离子有关。细胞内铜离子的异常水平与威尔逊氏病，孟克斯病，老年性痴呆等疾病的发生发展密切相关。

肿瘤细胞中铜离子的水平高于正常细胞，并且肿瘤细胞的增殖和扩散与细胞内铜离子密切相关。目前有一些工具可用于检测细胞内铜离子，例如同位素标记，ICP-MS和化学荧光探针。尽管使用化学荧光探针跟踪金属离子在细胞内的存储已取得很好的进展，但它们仍存在许多需要解决的问题，例如铜探针可以检测到的铜离子浓度范围很小，无法实时检测细胞内铜离子变化的动态等。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜离子的活细胞检测的方法，有效地感知细胞内铜的变化，为筛选铜靶向药物和研究铜相关细胞生理病理机制提供帮助。

本发明的一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统，它是由金属硫蛋白的MT1F与EGFP结合形成的检测系统；所述的MT1F为MT1F启动子与EGFP结合，其中，MT1F启动子的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

进一步地，所述的检测系统用于检测活细胞内Cu(I)变化。

进一步地，所述的检测系统是将MT1F启动子连接到含有GFP的慢病毒干扰载体pLV3-GFP-Puro-H1上形成慢病毒载体作为检测系统。

进一步地，所述的MT1F启动子是以8988T人胰腺导管上皮癌细胞基因组DNA为模板，通过以下引物进行PCR扩增得到；

MT1F-P-LV3 F：ATCGCTATTACCATGTCTAGATATTGAAGGGAATTAACCACTTGTCT；MT1F-P-LV3 R：CTCTCCATGGTGGCGTCTAGATGCAAGCCGAGGAGAGACTG。

本发明的一种利用金属硫蛋白构建活细胞内铜变化的检测系统应用，它用于检测活细胞内铜变化，所述的铜为Cu(I)。

进一步地，所述的活细胞为Panc-1细胞、8988T细胞、293T细胞、HepG2细胞和肝细胞

本发明的P_MT1F-EGFP报告系统的工作机制：

本实施例建立的铜报告系统工作机制为：细胞外铜离子通过SLC31A1进入细胞，然后与细胞内铜结合蛋白如MT1F，以及含有铜离子结合位点并对铜敏感的MTF1结合。MTF1作为与MT1F启动子结合的转录因子进入细胞核，促进MT1F的表达。MT1F在细胞质中表达，反映细胞中铜离子的水平(图6)。