[发明专利]一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组毕赤酵母及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组毕赤酵母及其构建方法与应用，所述重组毕赤酵母是通过在毕赤酵母GS115的基因组表达岩藻糖‑1‑磷酸鸟苷转移酶和岩藻糖激酶得到的。通过改造获得了可合成鸟苷二磷酸岩藻糖的菌株，可以高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖。本发明重组毕赤酵母的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组毕赤酵母 及其构建方法与应用。

背景技术

鸟苷酸二磷酸岩藻糖(GDP-L-Fuc)是岩藻糖(L-fucose)的核苷酸形式，它为岩藻糖基化反 应提供岩藻糖基受体，在生命体的组织生长、血管再生、受精细胞黏附、炎症和肿瘤转移等 方面起重要作用。同时，含有岩藻糖基的寡糖是母乳的主要组成部分，其功能涉及广泛的生 物学过程，例如，预防病原体感染，改善免疫系统反应，减少炎症反应等。藻糖基化的寡糖是在岩藻糖基转移酶的催化下以鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供体合成 的。因为岩藻糖基寡糖的广泛作用而产生巨大需求，所以许多制药公司试图通过化学方法和 生物方法高效合成充足的鸟苷二磷酸岩藻糖。在化学合成中，鸟苷二磷酸岩藻糖是以L-岩藻 吡喃糖基四乙酸为起始原料进行合成，但化学合成伴随有多个保护和脱保护步骤，这种复杂性使得化学合成对于工业应用而言是不现实的。生物合成是基于在生物体中发现了两种合成 GDP-L-fucose的代谢途径：补救途径和从头途径，这两种代谢途径均发生在细胞质中。鸟苷 二磷酸岩藻糖生物合成如图1所示。

补救途径是在人类的代谢途径中发现的，外源的岩藻糖转移到胞内，由岩藻糖激酶消耗 ATP被磷酸化(EC2.7.1.52)继而形成岩藻糖-1-磷酸(Fuc-1-P)。Fuc-1-P结合鸟苷三磷酸(GTP)在 岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(L-fucose-1-phosphateguanylyltransferase)(EC2.7.7.30)的催化下 生成GDP-L-岩藻糖。从头合成途径它首先在细菌中发现，然后被发现在植物、哺乳动物和无 脊椎动物中均存在，在此途径中，GDP-岩藻糖是由GDP-甘露糖通过鸟苷二磷酸甘露糖脱水 酶(GMD，EC4.2.1.47)和鸟苷二磷酸甘露糖差向异构酶(WCAG，EC1.1.1.271)催化合成的。

毕赤酵母作为外源蛋白表达的优良宿主被广泛应用，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。

因此，如何利用毕赤酵母，通过生物方法高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖，仍是本领域亟待 解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组毕赤酵母的构建方法与应用， 构建的重组毕赤酵母可以高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种载体，所述载体含有岩藻糖-1-磷酸鸟苷转移酶的表达序 列和/或岩藻糖激酶的表达序列。

在本发明的一些实施方式中，所述岩藻糖-1-磷酸鸟苷转移酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，所述岩藻糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施方式中，所述岩藻糖-1-磷酸鸟苷转移酶来源于野猪(Susscrofa)的 FPGT基因，所述岩藻糖激酶基因来源于野猪(Sus scrofa)的FCSK基因。

在本发明的一些实施方式中，所述岩藻糖-1-磷酸鸟苷转移酶的表达序列如SEQID NO.3 所示，所述岩藻糖激酶的表达序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一些实施方式中，所述载体的序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第一方面所述的表 达载体，其中所述细胞为非植物细胞。