[发明专利]一种针刺血清外泌体及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.类风湿性关节炎模型的建立

于大鼠右后足足底注射完全弗式佐剂致炎，24小时后，对大鼠进行介入电针治疗，并利用全自动热辐射刺激仪测量大鼠足底痛阈，根据痛阈测量结果判断类风湿性关节炎模型是否造模成功；

S2.提取血清

对造模成功的大鼠进行腹主动脉血液样本采集；

血液样本静置2h后，于4℃、2000rpm的离心机中离心10min；

离心后，取上清液为血清，分装于EP管中，且每个EP管中分装500μL血清，并全部放入-80℃的冰箱中冻存备用；

S3.提取外泌体

取步骤S2中冻存的血清，在4℃的冰箱中充分解冻；

血清解冻后，于4℃、3000gpm的离心机中离心15min；离心后，取上清液过滤，并收集滤液；

按4：1的混合比向所述滤液中加入沉淀剂，均匀混合；

将混合后的混合物置于4℃的冰箱中孵育30分钟；

孵育后，于4℃、1500gpm的离心机中离心5min；离心后，去除上清液，获得米白色外泌体沉淀颗粒。

2.根据权利要求1所述的一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于：在所述步骤S1的类风湿性关节炎模型的建立中，以痛阈降低75％为造模成功标准。

3.根据权利要求1所述的一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于：在所述步骤S1的类风湿性关节炎模型的建立中，利用1寸针灸针和SDZ-V型电子针疗仪对大鼠双侧足三里穴和环跳穴进行介入电针治疗，且三里穴处的针灸针与电子针疗仪正极连接，环跳穴处的针灸针与电子针疗仪负极连接。

4.根据权利要求1或2所述的一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1的类风湿性关节炎模型的建立中，测量大鼠足底痛阈的同时还包括：

利用游标卡尺测量大鼠足肿胀程度；

利用PSI激光多普勒血流仪测量大鼠局部充血状态。

5.根据权利要求4所述的一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于：所述足底痛阈通过热辐射刺激下大鼠患侧缩足时间表示；所述足肿胀程度通过大鼠患侧脚掌厚度表示；所述局部充血状态通过大鼠患侧足踝部皮肤的血流灌注量表示。

6.根据权利要求5所述的一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于：在测量局部充血状态之前，还包括将大鼠放入动物气体麻醉机中通气麻醉，且所述麻醉机中麻醉剂的通气浓度为异氟烷：氧气＝4：1mL/min。

7.根据权利要求6所述的一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2的提取血清在大鼠麻醉后进行。

8.根据权利要求1所述的一种针刺血清外泌体的制备方法，其特征在于，在所述步骤S3的提取外泌体中，还包括：

利用PBS缓冲液将外泌体沉淀颗粒重悬分装于EP管中，且外泌体沉淀颗粒：PBS缓冲液＝5：1，分装后保存于-80℃的冰箱中。

9.一种针刺血清外泌体，其特征在于：根据权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的类针刺血清外泌体在制备用于治疗类风湿性关节炎药物中的应用。