[发明专利]一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：使用还原法提取患者自身头发角蛋白，透析去除多余的离子，活性炭吸附去除内毒素，调整蛋白浓度为0.1‑20mg/ml，冷冻干燥后钴源照射灭菌，形成无菌角蛋白微球；人干细胞接种于微载体中，通过连续扩增，获得大量3D培养的含自身干细胞的角蛋白复合物。本发明的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物对各类的临床的软骨修复有较大的临床使用价值和应用价值，因材料均来自于自体，无排斥，有较好的生物相容性，应用简单方便。

技术领域

本发明涉及细胞生命科学技术领域，具体来说，涉及用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法。

背景技术

以蛋白为基础的生物材料，如胶原蛋白、弹性蛋白等，已被广泛用于构建组织工程支架。一般来说，蛋白基生物材料通过水解途径的酶解具有良好的生物相容性和生物降解性。它们还具有内在的生物活性，基于蛋白质的材质如果广泛临床，则会受到低成本大规模获得的挑战带来的限制。合成或重组肽低聚物或蛋白质作为支架材料尽管取得了一定的成功，但仍然是比较昂贵的。虽然从动物来源提取的蛋白质如胶原蛋白等可以大量获得，也存在潜在的安全问题，包括植入人体后外源性蛋白质可能传播疾病或引起严重的免疫反应。

人发中角蛋白含量约占总质量的65％～95％，而每年我国产生的人发废渣达几十万吨。角蛋白是一种多肽，独特的分子结构、高分子量使得它具有优良的生物学特性和良好的材料力学性能、机械性能，此外，其降解速率先慢后快，来源于机体本身、无异源性和任何免疫排斥反应，促进细胞的黏附和分化以及周围神经的快速再生，是临床移植等应用领域极具潜力的新型生物医用材料。

通过角蛋白微珠同自体间充质干细胞结后，大量扩增，获得角蛋白干细胞复合物，刺激干细胞向软骨分化，具有良好的软骨修复效果，对膝关节半月板等软骨损伤具有较好的修复作用，因材料完全来自于自体，无排斥，有较好的生物相容性和临床应用价值。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法，能够克服现有技术的上述不足。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)使用还原法提取患者自身头发的角蛋白，获得含有巯基的角蛋白溶液，使用去氧纯净水通过8KD透析袋去除多余的盐离子，活性炭吸附去除内毒素，调整角蛋白溶液中的蛋白浓度为0.1-20mg/ml，使用喷雾的方式，把角蛋白溶液喷射到液氮中，速冻形成角蛋白微球，冷冻干燥过程中，还原性角蛋白通过新生二硫键形成稳定结构，钴源照射灭菌；

(2)将患者自体干细胞接种于角蛋白微球中，使用反应瓶进行搅拌，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养，通过连续扩增，获得大量3D培养的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物(即含自身干细胞的角蛋白复合物)。

优选的，所述干细胞为自体脂肪、牙髓、脐带或骨髓来源的间充质干细胞。

优选的，所述角蛋白微球的粒径为10-10000um。

优选的，步骤(2)中干细胞的接种密度为1～5×10⁶cells/ml。

根据本发明的另一方面，提供了一种由上述制备方法得到的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物。

本发明的有益效果：本发明的用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法获得还原性角蛋白，通过透析去除杂质，活性炭吸附去除内毒素，经钴源照射，可获得临床级别的角蛋白微球；采用还原法打开二硫键，通过后期缓慢冷冻干燥促使新的二硫键交联，形成稳定的角蛋白微球；角蛋白微球的三维结构，适于干细胞向软骨分化，高表达软骨基因，利于干细胞对软骨的修复，形成的角蛋白与干细胞复合物，不同于干细胞本身，利用于软骨损伤部位定植。