[发明专利]一种α-琼胶酶基因及其编码酶的应用

说明书

本发明公开了一种α‑琼胶酶基因及其编码酶的应用，属于微生物工程技术领域。本发明提供了一种具有特定碱基序列的α‑琼胶酶，并且成功的采用食品安全菌株枯草芽孢杆菌对α‑琼胶酶进行异源表达，本发明的方法安全、高效，可应用于食品、药品的生产中，并且，采用本发明的方法，所表达的α‑琼胶酶粗酶液的催化活力可高达523.1U/mg。本发明提供的α‑琼胶酶具有较好的比酶活与热稳定性，且底物转化率也较高；本发明的α‑琼胶酶的琼胶转化率和产物纯度较高，经计算得到转化率可达约53％，有利于工业生产。

技术领域

本发明涉及一种α-琼胶酶基因及其编码酶的应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

琼胶是一种由石花菜及其他红藻类植物其取出来的一种具有经济价值的海洋多糖。琼胶经过水解后生成聚合度为2～20的琼胶寡糖，具有水溶性好，生物利用度高等优点，可广泛应用于食品、药品和化妆品等领域。

琼胶寡糖具有许多独特的医疗保健功能，可作为功能性食品、药品和化妆品的原料，主要表现为：1)琼脂寡糖具有抗氧化作用，能够直接或通过提高抗氧化酶类的活性来清除活性氧自由基，还可以通过琼脂寡糖与自由基必须的金属离子螯合起到抑制氧化的效果。因此可以应用于抗疲劳等功能的保健食品中。2)琼脂寡糖能够抑制巨噬细胞和单核细胞中一氧化氮的产生量、前列腺素E2含量以及促炎症反应的细胞活性物质水平的提高，具有抗肿瘤、提高免疫力的功能。可以用于生产抗肿瘤、抗炎症、抗病毒等药品生产中。3)研究发现琼胶寡糖具有良好的保湿美白功效，能够抑制黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性，并且对细胞没有毒性。因此可以用作化妆品的优质原材料。4)琼脂寡糖具有一定的抑菌活性，能够抑制细菌生长。琼脂寡糖能够作为食品中良好的天然防腐剂，还可以降低食品热量。5)体内、体外实验证明新琼寡糖耐受消化酶的作用，可以改善肠道菌群结构，促进肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌的增值，抑制致病菌的生长。其中高聚合度的琼胶寡糖抑菌效果优于低聚合度的琼胶寡糖。因此琼胶寡糖可以作为开发新型益生元制剂的原料。

近年来，我国对琼脂的开发规模较小，产品多限于作为化工和医药等原料出口的琼脂和琼脂粉，附加值低，易污染环境。为合理利用琼脂资源，生产琼胶寡糖等高附加值产品对防止资源浪费、增加经济效益、保护环境等具有重要意义。目前工业上主要利用酸水解和酶解两种方式制备琼胶寡糖，酸水解法效率高、产量大，但会产生大量副产物，存在琼胶寡糖分离提纯困难、具有安全隐患等问题；而琼胶酶酶解方法具有催化效率高、底物特异性强、反应条件温和等优点，是降解琼脂多糖的首选方式。但大多数利用酶法降解琼脂多糖的研究还处于实验室研究阶段，主要问题是产琼脂酶的菌株大多数来自于海洋，菌株产酶性状不稳定、产酶量低，使生产琼胶酶的成本高，价格昂贵，难以实现商业化应用。因此，寻找一种水解活力高，性状稳定的琼胶酶基因，并实现异源表达成为生产琼胶酶的最经济高效的方法。

琼胶酶分为α-琼胶酶和β-琼胶酶，其中α-琼胶酶水解α-1,3糖苷键生成琼寡糖，β-琼胶酶水解β-1,4糖苷键生成新琼寡糖。研究报道琼四糖和琼六糖相比于其他琼胶寡糖具有更好的抗氧化性能，但由于目前发现的琼胶酶绝大多数为β-琼胶酶，仅有四个α-琼胶酶的性能被挖掘和报道，且其稳定性、酶活和产物特异性均有待提高，因此琼四糖和琼六糖的大量工业化制备和应用收到了严重的限制。

国内外研究者一直在尝试对琼胶酶的异源表达，以期大幅提高其产量，突破天然酶的分泌限制，而现有的研究主要集中于酶在大肠杆菌中的克隆表达，且主要定位于细胞质或周质空间，不利于酶的分离纯化及其在食品、医药等领域中的应用。即使是在枯草芽孢杆菌中分泌表达，分泌量也相对较低，因此，有必要建立并优化更安全、高效的琼胶酶食品级枯草芽孢杆菌分泌表达体系。

发明内容

为了解决现有技术当中α-琼胶酶来源稀少、表达量低、产物转换率低、特异性差等问题，本发明提供了一种编码α-琼胶酶的基因，所述α-琼胶酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述α-琼胶酶的基因是在核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示α-琼胶酶WT的基础之上优化得到的。