[发明专利]一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，用于编码该羰基还原酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；其中，由SEQ ID NO.4所编码的羰基还原酶突变体，在酸性条件下，催化活性高、耐热性好，可应用于制备肾上腺素及其类似物的生物合成中；与化学合成方法相比，其所催化的羰基还原反应简单温和，无废物排放，反应选择性高，制备成本低，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物转化领域，具体涉及一种用于制备肾上腺素及其类似物的羰基还原酶突变体及其编码基因。

背景技术

生物转化技术是一种以微生物细胞或酶作为催化剂进行物质转化的技术。它具有条件温和、副反应少、选择性强、能耗低以及对环境友好等优点，已经在绿色化学和医药领域广泛应用。其中酶作为一种常见的生物催化剂，在生物催化过程中具有具足轻重的作用。

氧化还原反应是重要的一类化学反应。其中将不饱和羰基化合物及其衍生物还原为手性醇类化合物的反应是药物化学和有机合成中非常重要的反应。目前，不饱和羰基化合物的手性还原主要采用化学方法。利用化学方法还原通常需要采用Pb/C、纯氢以及需要进行手性拆分，不仅成本高，操作繁琐费时，且容易造成环境污染。

羰基还原酶(carbonyl reductase)又可称作酮还原酶、醇脱氢酶，广泛存在于动物、植物及微生物细胞之中，是一种以NAD、NADP、NADH或NADPH为辅酶的蛋白，既可以催化羰基还原，也可以催化羟基的氧化，具有广泛的底物特异性。根据其典型的序列和结构组成特征，羰基还原酶又分为短链(SDRs)、中链脱氢酶/还原酶家族(MDRs)以及醛酮还原酶家族(AKRs)。此外，羰基还原酶还可以NAD(P)H为辅酶，催化羰基双键的还原。

其中，肾上腺素及其类似物(化学结构如式a所示)具有重要的生理功能，它们能调节人体的血压、心率、心力、胃肠运动及支气管平滑张力。这类药物主要用于支气管哮喘病、心血管等病症的治疗，市场容量较大。具体地，在肾上腺素类似物(式b所示化合物)的合成路线中，最后一步为羰基经钯碳催化加氢成为羟基的过程，该步骤需要用的钯催化剂较为昂贵，且工艺过程安全性较差，生成的产品是消旋产品，需要经过多步拆分过程，总体收率较低。

除了化学合成外，用生物酶也可以在水相中催化肾上腺激素及其类似物的合成。但是由于原料在中性及碱性pH的水相中溶解度低，而在低pH值时，酶的催化效率低、半衰期短。因此，需要对现有的羰基还原酶进行改进，以提高其在酸性条件下的催化活性和/或稳定性，进而改善现有技术中肾上腺激素及其类似物生产成本高等问题。

发明内容

为了解决化学合成肾上腺素及其类似物(即催化还原式I所示化合物)过程中存在的生产成本高、后处理难度大；以及生物催化酶在酸性条件下，催化活性低以及稳定性差的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种酸性体系中，催化活性高、热稳定性好的羰基还原酶突变体。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种羰基还原酶突变体基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；该基因所编码的羰基还原酶突变体的氨基酸序列如：SEQ ID NO.3所示。

本发明所提供的羰基还原酶突变体基因，来源于Agrobacterium radiobacter的野生型基因。该野生型基因针对大肠杆菌进行密码子优化后的基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作有意修饰。这些基因表达后得到的酶对于某些底物的催化活力低，热稳定性较差。