[发明专利]高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体

权利要求书

1.一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体为Ad5-L.m-PEPCK，具体通过以下步骤制备得到：

步骤1，合成携带在羧基末端含6x His标签的PEPCK全长编码基因；

步骤2，对步骤1合成的羧基末端含6x His标签的PEPCK基因进行修饰，即在PEPCK基因羧基末端添加11个额外的修饰氨基酸；

步骤3，构建重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK；

步骤4，将步骤3构建的重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK与pAdEasy-1载体进行同源重组，生成所述重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK；

步骤5，重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于：所述步骤2中11个额外的修饰氨基酸为GRALEHHHHHH。

3.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述步骤3的具体过程为：将经过步骤2修饰后的PEPCK基因和pShuttle-CMV载体分别通过NotI和EcoRV进行双酶切，然后用DNA连接酶连接，将连接产物转染进大肠杆菌DH5α中，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，通过DNA序列测定鉴定出重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK。

4.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述步骤4的具体过程为：

用PmeI限制性内切酶切割重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK，然后用碱性磷酸酶在37℃处理30min，使用琼脂糖进行分离、纯化；

将上述分离、纯化后的pShuttle-CMV-Leish-PEPCK载体和pAdEasy-1载体按质量比10：1在冰上混合后，使用电转化仪器转入感受态BJ5183细菌中进行同源重组；

将上述转化的细菌涂布在含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，提取的DNA再转化大肠杆菌DH5α，小量扩增培养，再提取质粒DNA，用限制酶切和DNA测序鉴定出同源重组的质粒pAd5-L.m-PEPCK

提取重组腺病毒质粒pAd5-L.m-PEPCK的DNA，经PacI酶切，通过苯酚提取和乙醇沉淀或DNA纯化试剂盒纯化后，使用磷酸钙共沉淀法将DNA转染到293细胞，以生成所述重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK。

5.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于：所述步骤5重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的分离纯化的具体过程为：

收集步骤4中含有病毒空斑的293细胞，保留2ml细胞培养液，反复冻融3次，2000rpm离心15分钟，去除沉淀物，将含有Ad5-L.m-PEPCK的上清作为原代载体；

将293细胞用上述原代载体Ad5-L.m-PEPCK感染，感染复数为1个噬菌斑形成单位，感染48小时后，收集感染的细胞并冷冻融化3次，将细胞裂解物用1.2和1.4g/ml CsCl进行逐步梯度离心，并以35000rpm超速离心2h，收获主要条带，然后透析到透析液中，-80°保存。

6.据权利要求5所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于：所述透析液为100mM蔗糖；10mM Tris-HCl,PH 8.0；2mM MgCl₂；所述透析具体为在4℃，每6h更换一次透析液，透析24h。

7.一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体的应用，其特征在于：可用于利什曼病的疫苗。