[发明专利]红细胞叶酸的检测方法

权利要求书

1.一种红细胞叶酸的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)红细胞准备程序

S1，将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃保存和运输，最长72小时内进行如下操作：使用0至4℃等渗无毒性液体润洗红细胞至少1次并制成红细胞悬液；检测红细胞悬液的红细胞压积；或者，

S1’，将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃保存或运输，最长72小时内进行如下操作：使用0至4℃等渗无毒性液体润洗红细胞至少1次，离心，收集红细胞，在-40至-80℃冻存；向冻存的红细胞中加入两倍红细胞体积的1％抗坏血酸溶液，使红细胞解冻混悬，制成红细胞裂解液；检测红细胞裂解液的血红蛋白浓度；

(2)叶酸提取和检测

分别向S1中得到的红细胞悬液或S1’中得到的红细胞裂解液和叶酸标准品溶液中加入叶酸提取液，37℃孵育30min-2h；再使用能够沉淀蛋白质的化学试剂去蛋白，得到上清液，直接对上清液进行叶酸LC-MS/MS检测，并根据标准品浓度计算出红细胞悬液或红细胞裂解液中叶酸的浓度；

(3)叶酸浓度计算

根据以下公式计算叶酸浓度

红细胞叶酸浓度＝红细胞悬液中叶酸浓度/红细胞悬液的红细胞压积；或

红细胞叶酸浓度＝红细胞裂解液中叶酸浓度/(红细胞裂解液血红蛋白浓度*0.0029)。

2.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，本发明步骤(1)中，所述等渗无毒性液体是指能够用于红细胞润洗过程的pH中性的等渗无毒性液体。

3.根据权利要求2所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，所述等渗无毒性液体为生理盐水或磷酸缓冲液。

4.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，S1包括以下步骤：将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃避光暂存，72小时内0至4℃下避光运输至检测实验室；检测实验室收到样本后，完成以下操作：离心分离血浆，弃上清，加入等渗无毒性液体；混匀，离心，弃上清，加入两倍红细胞体积的等渗无毒性液体，制作成红细胞等渗无毒性液体悬液。

5.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，S1’包括以下步骤：将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃避光暂存，72小时内0至4℃下避光运输至本地样本处置点：处置点收到样本后，完成以下操作：离心分离血浆，弃上清，加入等渗无毒性液体；混匀，离心，弃上清，收集红细胞，在-40至-80℃冻存；样本干冰内运输至检测实验室；检测实验室收到样本后，完成以下操作：向冻存的红细胞中加入两倍红细胞体积的1％抗坏血酸溶液，使红细胞解冻混悬，制成红细胞裂解液；检测红细胞裂解液的血红蛋白浓度。

6.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，步骤(2)中，所述叶酸提取液是指能提供抗氧化环境，并且含有能将叶酸多聚谷氨酸盐水解为叶酸单谷氨酸盐的酶的水溶液。

7.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，所述叶酸提取液包含：1％抗坏血酸或DTT或TCEP或β-巯基乙醇；1μg/ml GGH重组酶或含有GGH酶的动物血浆或组织提取液或从动物组织中纯化的GGH酶；同位素标记的5-甲基四氢叶酸内标。

8.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，步骤(2)中，对上清液进行叶酸LC-MS/MS检测的检测条件如下：

仪器：SCIEX 6500+LC-MS/MS

色谱条件：色谱柱使用ACQUITY UPLC BEH C18 Column,1.7μm,2.1mm X 50mm进行分离，流动相用水(0.1％甲酸)作为A相，甲醇(0.1％甲酸)作为B相，柱温40℃；进样量为5μL，流速0.5ml/min，进行梯度洗脱；

质谱条件：采用电喷雾离子源，以正离子采集模式通过多反应监测模式进行质谱扫描。

9.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，步骤(2)中，所述能够沉淀蛋白质的化学试剂是指能导致蛋白沉淀的有机或无机溶剂。