[发明专利]一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用

说明书

本发明属于抗体检测技术领域，具体涉及一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用，本发明血小板抗体筛查方法包括如下步骤：S1：用细胞膜荧光染料对血小板进行荧光标记，得到荧光标记的血小板；S2：向包被有第二抗体的固相载体(U型ELISA板)中加入待检样本孵育；S3：将步骤S1获得的荧光标记的血小板加入孵育后的待检样本中，孵育、离心后直接通过荧光显微镜观察血小板的聚集分布情况，进而判断待检样本中是否含有抗血小板抗体。本发明筛查方法具有操作简单、省时省力、成本低的优势，更重要的是本发明血小板抗体筛查方法直接基于荧光标记血小板聚集分布情况来检测血清或血浆中同种抗体，具有较高的检测特异性。

技术领域

本发明属于抗体检测技术领域，具体涉及一种基于细胞膜荧光标记的血小板抗体筛查方法及其应用。

背景技术

血小板(Platelet，PLT)表面具有复杂的抗原系统，包括与其它组织或细胞所共有的抗原，如ABO抗原和HLA抗原(HLA-A，-B，-C)；存在于血小板膜糖蛋白上的特异性同种抗原(Human platelet antigens,HPAs)；共同存在于血小板、单核/巨噬细胞以及有核红细胞的GPⅣ/CD36，以及血小板上的胶原受体GPⅥ。怀孕、输血以及器官移植等方式导致上述血小板相关抗原免疫机体而诱导产生抗体，包括HLA抗体、HPA抗体和CD36抗体等。这些抗体会导致非溶血性发热反应、血小板输注无效、胎儿和新生儿同种免疫血小板减少症、输血后紫癜。为保障临床输血安全和疗效，有效预防输血不良反应和血小板输注无效，节约血液资源，辅助诊断血小板抗体相关免疫性疾病，血小板抗体检测已逐渐成为临床输血前免疫学检测常规。

目前，血小板抗体检测的方法主要包括如下三种：(1)固相凝集法(solid-phasered cell adherence,SPRCA)，将富含血小板的血浆加入微量板，使血小板固定在孔底，与被检血清反应，以抗IgG致敏的红细胞指示反应结果。如果血小板上无抗体，则指示细胞聚集在孔底，形成细胞扣，为阴性结果，反之则为阳性。(2)单克隆抗体特异性血小板抗原捕获法(Monoclonal antibody immobilization of platelet antigen assay,MAIPA)，将血小板特异性抗原固定，然后用待检血清与之反应，然后加入辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)标记的抗人IgG反应、显色，终止反应后测490nm处的吸光度值以此来鉴定血小板特异性抗体，为临床上鉴别免疫性与非免疫性血小板减少提供了特异性诊断方法，可以定量测定血小板抗体，具体如下图1所示。此方法敏感度高、特异性强，即使是血小板上抗原数量很少的HPA-5抗原，也能检测出，是目前使用最为广泛的方法。(3)抗原捕获酶联免疫吸附试验(Modified antigen capture ELISA,MACE)，将致敏血小板与单克隆的HLA-I类抗体和GPIIb/IIIa,GPIa/IIa,GPIb/IX,GPIV抗体反应，然后加抗人IgG反应、显色，终止反应后测405nm处的吸光度值，吸光度值等于或大于2倍阴性对照吸光度值的结果即为阳性。此方法特异性较高，操作相对简便，可以检测针对血小板特异性抗原，HLA抗原的IgG抗体，适用于确诊试验和区分血小板抗体类型。

然而，上述现有技术仍存在如下问题：(1)检测特异性低，假阳性率高。与红细胞不同，血小板是一种无色或淡黄色小块胞质，无论是聚集还是散在的单个血小板，未染色时均不宜通过显微镜或肉眼检出；现有检测技术并不是直接检测血小板与同种抗体的结合情况，而是通过抗IgG致敏的指示红细胞或HRP标记的抗人IgG显色间接反映血小板与同种抗体的结合情况。通过多重抗体或酶联免疫显色的逐级放大，在提高检测敏感性的同时，也大大提高了实验结果的假阳性率，降低了实验的特异性。(2)操作繁琐，耗时长。因现存技术操作流程并不是直接检测血小板和同种抗体的结合情况，而是间接通过抗IgG致敏的指示红细胞或HRP标记的抗人IgG显色间接反应血小板与同种抗体的结合情况，操作流程繁琐，单人份实验至少要2～3h，耗时较长。(3)成本高。现有技术也涉及多重抗体或酶联免疫显色的放大反应，所需抗体种类较多(2～4种)，除此之外，还需配套相应的指示红细胞或显色底物，成本较高，进而导致检测价格昂贵。

发明内容