[发明专利]GSH合成和循环相关蛋白的应用以及重组酿酒酵母菌株

说明书

本发明涉及微生物技术领域，公开了GSH合成和循环相关基因的应用以及重组酿酒酵母菌株。本发明选取来源于Kluyveromyces marxianus，海洋耐酸菌Wallemia mellicol以及极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27的GSH合成和循环相关基因构建具有优良抗逆性重组酿酒酵母菌株，相比较野生型酿酒酵母，重组酿酒酵母根据外源基因的不同在耐H₂O₂、耐热激、耐高温、耐酸和耐盐上表现出不同效果，不仅为工业发酵生产提供优良的酵母菌株，并且为之后研究真核生物中ROS的发生或保护提供细胞模型。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体的说是涉及GSH合成和循环相关蛋白的应用以及重组酿酒酵母菌株。

背景技术

酿酒酵母处于高温，高盐，酸碱性等不利生存的条件下，会产生过量的活性氧(ROS)，使其遭受氧化损伤甚至导致死亡。酿酒酵母暴露于ROS时，就会引发细胞内氧化应激反应，因此其抗逆性与氧化应激息息相关。ROS产生的主要场所是线粒体，是氧化损伤最严重的细胞器，因此保护线粒体免受氧化损伤是抗氧化防御的重点。酿酒酵母抗氧化防御系统由酶促防御系统和非酶促防御系统组成。抗氧化保护酶是应对氧化应激的重要机制，其中包括超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(Prx)。非酶促防御系统由能够清除自由基的小分子组成，主要包括硫氧还蛋白(Trx)，抗坏血酸，谷胱甘肽(GSH)和其他还原剂。

SOD是最普遍且重要的抗氧化剂，它能够将催化超氧阴离子(O²-)还原为(H₂O₂)，然后CAT或Prx催化H₂O₂再还原为水(H₂O)。硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶(TRR1)和两种硫氧还蛋白(TRX1和TRX2)，在酵母细胞中，Trx具有抗氧化剂的活性，并且通过硫氧还蛋白系统在抵御氧化损伤过程中起着关键作用。抗坏血酸分子中的烯二醇基易被氧化，能够结合氧并将其清除，因此也具有抗氧化作用。然而酿酒酵母不能生成L-AA，它可以合成与其功能类似物-D-赤型抗坏血酸(D-EAA)。已有研究表明D-EAA在抗压方面起一定的作用，缺失编码催化D-EAA合成最后一步酶的基因ALO1的酵母菌株，对H₂O₂和O²-敏感。Monteiro等人提出，抗坏血酸可能参与1-Cys Prx的还原，揭示了抗坏血酸另外的抗氧化能力。

GSH的半胱氨酸残基具有氧化还原活性，参与机体多种生命活动之中，可以清除自由基，帮助细胞抵御氧化损伤。除此之外，GSH在酿酒酵母应对NaCl应激反应中也起关键作用。ROS介导的氧化损伤，最早响应的抗氧化应激之一是巯基的氧化，这说明了GSH作为应激防御酶的辅因子在抗氧化中发挥了非常重要的作用。高温等条件引起的氧化应激，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)能够催化GSH氧化成其二硫键形式(GSSG)，同时伴随着H₂O₂和脂质过氧化物的还原。反之，在GSSG还原酶(Glr1)的作用下，GSSG也可以被还原成GSH，同时伴随着NADPH的消耗，这样便形成了GSH氧化还原循环。CAT也可以还原H₂O₂，但是仅在过氧化物酶体中有该酶的存在。线粒体是氧化损伤最严重的细胞器，因此GSH系统对于保护线粒体减少氧化损伤起关键作用。Qiu等人通过Cre-LoxP系统提高GSH合成酶基因GCSGS拷贝数，将其整合到酿酒酵母核糖体DNA中，提高了三倍的GSH积累量，从而使酵母可以承受40度的高温。这说明通过提高酿酒酵母中的GSH含量能够提高其抗逆性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组酿酒酵母菌株，从优化GSH合成和循环入手，使得所构建的重组酿酒酵母菌株能够表现出较佳的耐H₂O₂、耐热激、耐盐、耐酸和耐高温等一种或多种抗逆性能；

本发明的另外一个目的在于提供GSH合成和循环相关蛋白或其编码基因在构建抗逆性重组酿酒酵母中的应用。