[发明专利]一种M-MLV逆转录酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种M‑MLV逆转录酶突变体及其应用，所述M‑MLV逆转录酶突变体的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示。本发明提供的逆转录酶，在野生型M‑MLV逆转录酶的基础上，结合已有对逆转录酶结构研究进展，融合多个突变体的结构特点，通过定点诱变理性设计筛选得到，该逆转录酶突变体具有很强的抑制物耐受性，降低了抑制物对cDNA合成的干扰，在添加全血以及痰液的样本反应过程中，本发明所述的突变型逆转录酶活性不受影响或影响很小。与此同时，本发明提供的逆转录酶突变体能够耐受70℃的高温，在具有较好热稳定性的同时，也具有较高的反应灵敏度和准确性，具有极强的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种M-MLV逆转录酶突变体及其应用。

背景技术

逆转录酶(Reverse transcriptase)通常具有三种活性：以RNA为模板的DNA聚合酶活性、以DNA为模板的DNA聚合酶活性以及降解RNA-DNA杂合链中RNA的RNase H活性。因此，逆转录酶常用于cDNA文库构建、mRNA测序、RT-PCR定量等，被广泛应用于研究及医学分子诊断领域。莫洛泥鼠白血病病毒(Moloney Murine LeukemiaVirus,MMLV)或禽类成髓细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus,AMV)pol基因产生的逆转录酶是两种最常用的逆转录酶，AMV逆转录酶的RNase H活性较高且热稳定性高，但产物的产量低；MMLV逆转录酶产量较高，但热稳定性差，因其单体结构特征，易于进行改造，在应用更为广泛。

逆转录酶的合成能力是其应用中十分重要的参数，具有高合成能力的逆转录酶通常具有高的底物亲和力或可高效催化合成cDNA。逆转录酶的RNase H活性可降解RNA-DNA杂合体中的RNA，可能会造成RNA模板在完成全长逆转录前被降解，降低逆转录效率，因此，商业化逆转录酶的RNase H活性通常会被改造以弱化其降解RNA-DNA杂合体中的RNA的功能，提高长链cDNA产量。模板RNA的形成二级结构也是影响逆转录酶催化效率的重要因素，通常可以通过提高反应温度来打开其二级结构，这就要求逆转录酶的反应温度相应提高。此外，生物学样本常含有会抑制逆转录酶活性的物质，如土壤和植物中的腐殖酸、血液中的血红素、粪便中的胆汁盐等，这些物质在RNA提取过程中并不能被完全去除，因此，提高逆转录酶对抑制物的耐受性是亟待解决的重要方面。

在提高逆转录酶的性能的研究中，主要集中于提高其热稳定性和催化效率上，其中Thermo Fisher使用体外区室化核糖体展示技术(Compartmentalized RibosomeDisplay,CRD)进行高通量筛选，获得热稳定性提高的不同的突变株。这些热稳定性提高的突变株，突变位点集中于酶的活性中心及RNase H结构域。但是热稳定性提高的逆转录酶可能会伴随催化活性降低以及抑制物耐受性降低的缺点。具有高温耐受性的逆转录酶可降低反应中引物二聚体的形成，对于检测低浓度模板具有优势，能够耐受血液或痰液等样本的逆转录酶可作为体外诊断试剂中分子诊断用酶，对于简化样本处理流程、减少污染有重要意义，因此临床上亟需一种具有较好热稳定以及催化效率，同时能够耐受抑制物的逆转录酶。

发明内容

基于上述技术问题，发明人根据蛋白结构特征及关键氨基酸位点进行理性设计，将具有不同优良性能的突变株性能结合，在野生型M-MLV逆转录酶的基础上，采用DNA改组技术，融合多个突变体的结构特点，结合高通量筛选方法得到一系列具有更强抑制物耐受性、更高热稳定性以及催化活性的逆转录酶。

本发明提供一种M-MLV逆转录酶突变体，采用如下技术手段：一种M-MLV逆转录酶突变体，其特征在于，所述M-MLV逆转录酶突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种重组表达载体，是将编码上述M-MLV逆转录酶突变体的DNA分子克隆入表达载体得到。

一种重组工程细胞株，是将上述重组表达载体转化入工程细胞得到。

一种逆转录反应试剂盒，包括如上所述M-MLV逆转录酶突变体。