[发明专利]一种细胞冻存方法

说明书

本发明涉及一种细胞冻存方法，属于细胞冷冻技术领域。本发明所述细胞冻存方法包括以下步骤：细胞收集前，在细胞培养液中添加糖类至终浓度为50～400mM，收集细胞后，使用含50～250mM糖类的糖溶液重悬细胞，冻存；所述糖类分别包括葡萄糖、蔗糖或棉子糖。本发明所述方法安全、高效，可实现细胞的长期低温高质量保存，且无需使用DMSO、甘油等对细胞有毒性的成分，有利于细胞药物的开发。

技术领域

本发明涉及细胞冷冻技术领域，具体涉及一种细胞冻存方法。

背景技术

细胞治疗涉及包括肿瘤在内的多种疾病的干细胞治疗和免疫细胞治疗，近些年细胞治疗更是成为生命科学和医学的前沿探索领域，细胞治疗的创新技术研究和临床研究为细胞治疗产业发展奠定了良好的基础。细胞治疗行业产业链包括细胞存储、细胞医疗技术以及细胞药物开发等；通过一定的方式从脐带、胎盘、骨髓等组织或脐带血、外周血中提取相应的原代干细胞或者免疫前体细胞，这些细胞作为种子细胞需进行存储备用；种子细胞可以通过培养扩增、基因编辑等技术进一步开发成为医疗技术或者细胞新药，无论是种子细胞存储还是细胞治疗医疗技术亦或是细胞新药开发，细胞冷冻保存都是举足轻重的环节，细胞深低温冻存可以极大地延长细胞功能时效，使细胞技术的规模化应用成为可能。

细胞的深低温冻存中，传统方式为收集目标细胞后使用冻存保护剂进行冷冻保存，使用的冷冻保护剂分为渗透型的保护剂和非渗透型的保护剂，渗透型的保护剂包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇等有机溶剂，非渗透性的保护剂则以大分子物质为主，包括右旋糖酐、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、聚蔗糖等，不同细胞保护剂对细胞的保存效果差别很大，需多种保护剂组合使用，制备保护剂工艺繁琐，且传统保护剂存在的最大问题便是DMSO、甘油等物质对细胞和人体产生的毒副作用，以及右旋糖酐、白蛋白等大分子物质潜在的过敏反应等风险，即使辅料级别的DMSO同样具有血管刺激，口腔黏膜刺激等副作用，在同细胞药物共同应用于肿瘤治疗中，患者器官机能受损，DMSO与大分子胞外保护剂会增加患者肝脏、肾脏等器官的代谢负担。

另一方面，使用传统含有DMSO、甘油等高渗透压物质的保护剂，对细胞药物的大规模制备也有较大的限制，细胞无法在高渗透压的环境下存活超过1～2h，即使有存活的细胞，其在活性及功能上也会受到较大的影响，其次，渗透性保护剂DMSO、甘油等温度越高对细胞的毒性便越大，这便使得细胞药物制备环境需严格控制在较低温条件，增加制备工艺难度，这也是目前限制细胞药物工艺开发及应用的关键与亟待解决的技术难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞冻存方法。本发明所述方法安全、高效，可实现细胞的长期低温高质量保存，且无需使用DMSO、甘油等对细胞有毒性的成分，有利于细胞药物的开发。

本发明提供了一种细胞冻存方法，包括以下步骤：

细胞收集前，在细胞培养液中添加糖类至终浓度为50～400mM，收集细胞后，使用含50～250mM糖类的糖溶液重悬细胞，冻存；

所述糖类分别包括葡萄糖、蔗糖或棉子糖。

优选的是，细胞收集前，糖类的添加时间为细胞收集前12～36h。

优选的是，细胞收集前，当所述糖类以溶液的形式添加时，溶剂为细胞培养所用的培养基。

优选的是，重悬细胞用的糖溶液的溶剂包括plasma LyteA。

优选的是，所述细胞包括脐带间充质干细胞或CIK细胞。

优选的是，所述冻存包括细胞降温冷冻和细胞长期冻存。

优选的是，所述细胞降温冷冻包括：将细胞在-80℃条件下维持12～16h。

优选的是，所述细胞长期冻存的温度为-80℃～-196℃。