[发明专利]一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法；核酸组合物，包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针；本发明发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有检测检测肺癌相关基因甲基化结果准确、时效性快，检测通量高、特异性好、敏感性好等优点。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。在中国肺癌是发病率最高的癌症，且发病率和死亡率逐年增长。肺癌的发生率和死亡率是所有肿瘤中最高的，但是肺癌却不是诊断的最多的肿瘤，在美国，乳腺肿瘤和前列腺肿瘤有更高的诊断率，而且早期诊断使早期治疗得以实现，大大提高了5年生存率(分别为89和99％)；与之对应的肺癌的5年生存率才15％。目前1期肺癌5年总体生存率可达80％，如果及早发现早治疗，肺癌患者5年生存率将会大大提高。

遗憾的是在临床实践中，肺癌早期诊断一直是难点。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、影像学检测和组织病理学检查等，但有许多癌症临床症状出现较晚，并且活体取样检测也困难，严重影响了癌症的早期诊断和病人的预后。具最新研究表明：癌细胞的DNA普遍存在着的反常甲基化，而一部分来自于癌细胞小片段DNA(ctDNA)会进入到外周循环血中。这些来自于癌细胞的携带反常甲基化小片段DNA可以用做肿瘤的早筛和检测。事实上，利用ctDNA的反常甲基化进行的肿瘤的早筛和检测已经成为国际国内研发热点。

DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的优势主要为：(1)肿瘤细胞相对于同类组织的正常细胞，DNA甲基化位点改变较多；(2)肿瘤DNA反常甲基化在肿瘤发生过程中出现较早；(3)DNA甲基化比较稳定。因此，甲基化检测对肺癌的早期筛查和诊断有很大的应用价值。

吸烟是引起肺癌的原因之一，在正常吸烟人群的呼吸道中发现了几种在人类肺癌中经常出现的基因异常。其中，研究较多的是CDKN2Ap16基因异常甲基化。对正常吸烟人群痰标本中的脱落细胞进行检测时，发现p16基因异常甲基化频率较高，而正常非吸烟人群痰标本中则没有发现该变化，说明这一基因改变可能与早期呼吸道肿瘤发生过程密切相关。痰液中相关基因启动子甲基化程度随着肿瘤危险性增高而增高，而CDKN2A/p16和/或CDKN2A基因在明确肺鳞癌诊断的3年前已可以在痰中检出。目前，有很多研究检测血液、痰液、肺泡灌洗液中的细胞或DNA甲基化状态，以期找到用于肺癌早期诊断的标志物。。

SHOX2(Short Stature Homeobox 2)，译为“矮小同源盒基因”，是同源盒基因家族的一员，为转录调控因子，其基因表达调控与器官发育密切相关。研究发现，SHOX2基因在胚胎时期表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要作用。另外，SHOX2基因甲基化与肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌等恶性疾病有关；且目前SHOX2基因甲基化已应用于临床检测，其在肺癌诊断、鉴别中的作用日渐明确。SHOX2不仅可以作为肺癌早期检测的标志物，而且其甲基化还可以作为非小细胞肺癌(NSCLC)预后的独立预测指标。

RASSF1A(Ras Association Domain Family Member 1)基因编码类似于RAS效应蛋白的蛋白质，是潜在的肿瘤抑制因子。RASSF1A调控的靶基因涉及基因转录、信号转导、细胞骨架、细胞周期、细胞黏附及调亡等多方面内容，具有广泛的生物学作用。而RASSF1A作为一种新型肿瘤抑制基因，其在肿瘤发生及发展过程中的作用尤为重要。目前认为，RASSF1A基因表达失活主要与启动子区异常的高甲基化、杂合性缺失及染色体缺失有关。人类肿瘤中RASSF1A基因失活的频率非常高。例如，RASSF1A基因在70％以上的小细胞肺癌，91％的肾细胞癌，62％的膀胱癌，71％的甲状腺癌，84％的鼻咽癌及70％以上的前列腺癌等中处于高甲基化状态进而失活。