[发明专利]一种百合LlKnat13基因克隆及其在控制百合珠芽形成中的应用方法

权利要求书

1.一种百合LlKnat13基因克隆及其在控制百合珠芽形成中的应用方法，其特征在于：包括如下步骤：

A、卷丹百合LlKnat13基因克隆方法：提取卷丹百合叶腋的RNA，根据转录组数据设计引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得其CDS区，扩增CDS序列引物如下，上游Llknat13-F：5′-ATGAGAGAGTCATACCACCCC-3′，下游Llknat13-R：5′-CTATGTGTAGCGTTCGGAGT-3′，扩增出的CDS序列进行测序，并与转录组序列比对，获得LlKnat13基因含完整ORF的cDNA序列，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示；

B、卷丹百合LlKnat13基因相对表达分析方法：提取卷丹百合叶腋的RNA，根据SEQ IDNO.1设计引物，以cDNA为模板，经qRT-PCR扩增，采用2^-ΔΔCt法分析Llknat13基因的相对表达水平，扩增引物如下：上游LlKnat13-qRT-F：5′-TCAGGGAAGAGATTCTACGCAAG-3′，下游LlKnat13-qRT-R：5′-TTCCTTCACCAATCGTGCCTT-3′；

C、基因在控制卷丹百合珠芽形成中的应用：根据SEQ IDNO.1设计带接头的引物LlKnat13-V-F5′-TTCTGTGAGTAAGGTTACCGATGAGAGAGTCATACCACCCCCA-3′和LlKnat13-V-R5′-CCCATGGAGGCCTTCTAGAGATCATGAGGCGCTGGATGTCCTT-3′，通过同源重组法将带有接头的LlKnat13基因目的片段与酶切后的TRV2线性载体连接，得到TRV2-LlKnat13载体，将构好的TRV2-LlKnat13载体转化农杆菌菌株EHA105，经活化摇菌至OD600＝0.8后抽真空5min对卷丹茎段进行侵染，之后将侵染茎段清洗干净并接种于MS+30g/L蔗糖的培养基中诱导珠芽形成，培养两周后观察统计，沉默组较对照相比珠芽诱导率显著下降。

2.根据权利要求1所述的一种百合LlKnat13基因克隆及其在控制百合珠芽形成中的应用方法，其特征在于：所述步骤A与所述步骤B中的叶腋通过用双面刀片切取卷丹叶腋，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，以提取的总RNA为模板，采用TransⅡOne-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成第一链cDNA。

3.根据权利要求1所述的一种百合LlKnat13基因克隆及其在控制百合珠芽形成中的应用方法，其特征在于：所述步骤B中卷丹百合叶腋的取材方式为：从离体培养的卷丹茎段上分别选取珠芽形成不同阶段，既：S0-S5的卷丹叶腋，每个阶段的样品取5-7个叶腋，分别从5株卷丹上获得，用锡箔纸包裹，液氮速冻，–80℃冰箱中保存备用，其中S0：未诱导培养的叶腋；S1-S3：珠芽原基启动形成；S4-S5：珠芽原基分化为珠芽。