[发明专利]产西柏三烯一醇的酿酒酵母的构建方法及应用

说明书

本发明公开了产西柏三烯一醇的酿酒酵母的构建方法及应用，属于代谢工程和微生物工程领域。本发明通过在酿酒酵母W303‑1A中异源表达西柏三烯一醇合成的2个关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶基因ggpps和西柏三烯醇合酶基因cbts，实现了西柏三烯一醇在酿酒酵母中的从头生产，并进一步通过与西柏三烯醇合酶基因cbts的串连过表达关键酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)，获得的重组菌株的西柏三烯一醇产量显著提高。将上述途径构建至酿酒酵母BY4741中，其西柏三烯一醇的产量提高至对照菌株的3倍。在关键酶法尼基焦磷酸合成酶基因前添加启动子，进一步提高重组酿酒酵母的西柏三烯一醇产量。

技术领域

本发明涉及产西柏三烯一醇的酿酒酵母的构建方法及应用，属于代谢工程和微生物工程领域。

背景技术

在全球杀虫剂市场的背景下，化学合成的活性化合物，如人造除虫菊衍生物和最显着的新烟碱类(如吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺；价值18.9亿美元)，其可快速作用害虫但非目标判别产品。新烟碱类是通过与烟碱乙酰胆碱受体不可逆结合而介导所有昆虫神经毒性作用的主要杀虫剂类别。化学农药具有诸多缺点，例如：易造成环境污染、目标种群逐渐养成抗药性、其对非目标种群具有负面性等。因此，这些化合物会影响害虫以及蜜蜂和熊蜂等有益昆虫，从而对农村地区的农作物和生物多样性的授粉产生负面影响。化学杀虫剂甚至危及工业农业活动和仍在增长的人口的可持续性。此外，这些化学品的生物降解性很差，导致环境积累，对陆地和水生生态系统的生物多样性产生负面影响。新烟碱类的广泛环境影响最近引发欧洲委员会严格限制这些化合物在农业活动中的适用性。

生物农药亦称为天然农药，是来自天然的化学物质或者生命体，具有杀菌农药和杀虫农药的作用。相比而言，生物农药具有诸多优点：选定的天然杀虫化合物对脱靶昆虫无毒、确保仅对农业活动和作物产量产生积极影响、对人畜安全、对生态环境影响小、诱发害虫患病、可利用农副产品加工生产、易被陆地微生物或光迅速降解、不会积累等。我国生物农业类型主要包括微生物农药、植物源农药、农用抗生素、天敌昆虫农药、生物化学农药、植物生长调节剂类农药等六大类型。西柏三烯一醇作为一种重要的二萜类化合物，是植物的分泌物成分，代表植物防御昆虫、病原微生物和食草动物的主要成分，在生物防治方面具有重要作用与意义。西柏三烯一醇只能在植物中以痕量检测到，但其具有显著的杀虫活性，且在自然降解过程中不会在生态圈中积累。

同时，西柏三烯一醇也是烟草中香味物质之一，对于烟草的品质具有重要影响与作用意义。虽然近年来西柏三烯一醇受到了一定关注，但相关报道与数据较少。西柏三烯一醇可以从植物中提取获得，但由于其在植物中只能以痕量检测到，含量较少。所以，通过从植物中提取的方法获得西柏三烯一醇具有一定的挑战，且生产成本太高，不利于其在农业生产中的应用。西柏三烯一醇具有复杂的化学结构又难以化学合成。因此，利用微生物生物合成西柏三烯一醇具有很大的前景及价值。研究表明萜类化合物在生物合成中可通过甲羟戊酸途径(MEV)合成，这为通过合成生物学方法在微生物宿主(如酿酒酵母)中生产西柏三烯一醇奠定了基础。作为真核微生物的酿酒酵母菌株，具有遗传信息清晰、生长快速、不易污染湿菌体、培养基廉价、对于化学物质(如萜类)具有较高耐受性等优点，适合用于精细化学品的高效生产。但单一的重组菌株构建方式，不利于重组微生物高效工业化生产西柏三烯一醇。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了产西柏三烯一醇的酿酒酵母的构建方法，通过关键酶法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)的过量表达、宿主优化、启动子调控等方法及应用，可高效生产西柏三烯醇，促进其在农业及烟草等领域中的应用。

本发明的第一个目的是提供一株产西柏三烯一醇的酿酒酵母菌株，表达了西柏三烯醇合酶、香叶基焦磷酸(GGPP)合酶和法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)；所述西柏三烯醇合酶含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述香叶基焦磷酸(GGPP)合酶含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述法尼基焦磷酸合成酶含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母以酿酒酵母W303-1A或酿酒酵母BY4741为宿主。