[发明专利]中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，包括反应液、逆转录引物、缓冲液1、缓冲液2、反应酶、内部质控、阳性质控以及稀释液。逆转录引物包括依次对应十八种病原体的第一至第十八逆转录引物组，序列如SEQ ID NO.1～36所示。缓冲液1中包含分别对应前12种病原体的第一至第十二扩增引物组以及第一至第十二探针；缓冲液2中包括依次对应后6种病原体的第十三至第十八扩增引物组以及第一探针、第三探针、第四探针、第六探针、第八探针和第九探针。第一至第十八扩增引物组序列如SEQ ID NO.37～72所示，第一至第十二探针序列如SEQ ID NO.73～84所示。本发明通过特异性设计引物和探针序列，成功实现了一次性对18种中枢神经系统感染病原体进行检测。

技术领域

本发明属于医学生物检测技术领域，涉及可同时检测出18种中枢神经系统感染病原体的检测试剂盒，以及其在中枢神经系统感染病原体检测中的应用。

背景技术

中枢神经系统感染是指各种生物性病原体(包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体、寄生虫等)侵犯中枢神经系统实质、被膜及血管引起的急性或慢性炎症性疾病，如引发脑炎、脊髓炎、脑脊髓炎、脑膜炎、脑脊膜炎等。临床上，中枢神经系统感染病人常常发生昏迷、抽搐、瘫痪、感觉异常、吞咽困难和大小便障碍等症状。昏迷、瘫痪病人不会咳嗽、翻身，又容易并发肺炎和压疮；突发抽搐可导致窒息，小便障碍易并发泌尿道感染，并发症的发生延长病程和加重病情，导致患者的护理和治疗工作繁重。

精准检测感染病原体对于对症治疗中枢神经感染疾病意义重大。传统的切片镜检病原微生物检测方法不适用中枢神经系统感染病原体检测，阳性率极其低，不超过10％。当前多采用分子检测手段进行，常用的分子检测手段有普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR。单重PCR是最早建立的PCR方法，只针对单个DNA模板进行扩增，实际应用中检测量巨大；多重PCR目前仅能同时检测少数几种中枢神经感染病原体，现有记载资料中一次性最多检测12种病原体，如专利号为CN108085408A的中国发明专利公开了一种能够快速检测细菌性中枢神经系统感染病原的引物和探针，实现一次性检测12种中枢神经细菌病原体，包括结核分枝杆菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓杆菌、脑膜奈瑟氏菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌。

然而，上述检测方法不涉及任何病毒病原体的检测，而由于免疫抑制剂的应用、化学治疗、放射治疗以及器官移植的开展，病毒性中枢神经系统感染率一直处于上升状态。上述专利检测方法的应用范围局限性很大。

新型检测方法如二代测序技术(next generation sequencing,NGS)，也被用于中枢神经系统感染病原体的检测种，如脑脊液NGS检测给神经感染的病原学检查带来了很大变革，但目前NGS的检测和解读仍存在很多问题，最大的问题在于灵敏度不够高。常见病原体的致病力较强，少量病原体即可致病，而对于少量病原体的检测，NGS并不如传统的培养和PCR方法。

综上，同时尽可能多的对中枢神经系统感染病原体进行检测仍是中枢神经系统感染病原体检测的发展目标。

发明内容

本发明是为解决上述技术问题进行的，提供了一种可以同时检测18种中枢神经系统感染病原体的检测试剂盒，采用的技术为多重荧光PCR技术，采用的原理为荧光能量共振转移，通过熔解温度范围判定检测结果，灵敏度高，结果明确易判读。

本发明的第一方面，提供了一种中枢神经系统感染病原体检测试剂盒，包括反应液、逆转录引物、缓冲液1、缓冲液2、反应酶、内部质控、阳性质控以及稀释液。

其中，所述逆转录引物系统包括依次对应人类肠道病毒、流感嗜血杆菌、EB病毒、肺炎链球菌、巨细胞病毒、无乳链球菌、单纯疱疹病毒1型、单核细胞增多性李斯特菌、单纯疱疹病毒2型、脑膜炎奈瑟菌、水痘带状疱疹病毒、双埃可病毒、格特隐球菌、腮腺炎病毒、新生隐球菌、人疱疹病毒6型、大肠杆菌K1以及金黄色葡萄球菌的第一至第十八逆转录引物组，每个引物组均包括正向引物和反向引物，序列如SEQ ID NO.1～36所示。