[发明专利]一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测犬IL-6的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括：pET-IL6单克隆抗体、pET-IL6多克隆抗体、酶标板、封闭液、羊抗兔酶标二抗、显色液、终止液；

其中，所述pET-IL6单克隆抗体和pET-IL6多克隆抗体是由pET-IL6蛋白通过免疫动物制备的抗体，所述pET-IL6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述pET-IL6单克隆抗体作为捕获抗体，pET-IL6多克隆抗体作为检测抗体。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液为2％～5％BSA、2％～5％脱脂奶粉的一种或多种；其中百分数为质量比百分数。

3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述pET-IL6蛋白的制备方法为：

扩增IL-6基因，将IL-6基因和载体pET-32a(+)连接，得到pET-IL6重组质粒；

将质粒转化到BL21大肠杆菌中，获得pET-IL6重组菌；用0.1～1.5mmol/L IPTG对pET-IL6重组菌进行诱导，22～42℃诱导培养2～6h，收集菌液，离心弃上清，沉淀后取上清，对所得蛋白洗涤溶解，进行纯化，即得pET-IL6蛋白；

其中，所述IL-6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述pET-IL6单克隆抗体的浓度为24～48μg/mL，pET-IL6多克隆抗体按1：500～1：100稀释。

5.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述羊抗兔酶标二抗的稀释度为1：1000～1：500。

6.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为四甲基联苯胺。

7.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为H₂SO₄。

8.权利要求1到权利要求7之一所述ELISA试剂盒，其特征在于，其使用方法包括以下步骤：

S1.包被：pET-IL6单克隆抗体，100μL/孔，加入酶标板内，将酶标板放入冰箱过夜；

S2.洗板：弃去S1中酶标板内液体，使用PBST进行洗板；

S3.封闭：在S2的酶标板中每孔加100μL的封闭液，于恒温箱37℃进行封闭，封闭后洗板步骤同S2；

S4.加样：在S3的酶标板中，每孔加入100μL样品，37℃条件下孵育，洗板步骤同S2；

S5.加检测抗体：将pET-IL6多克隆抗体用封闭液稀释，在S4的酶标板中每孔加100μL稀释后的pET-IL6多克隆抗体，于37℃条件下作用60min，洗板同S2；

S6.加二抗：向S5的酶标板中每孔加入稀释后的羊抗兔酶标二抗100μL，于37℃环境下孵育60min，洗板同S2；

S7.显色：避光环境下，向S6的酶标板中加显色液，100μL/孔，37℃条件下作用10min；

S8.终止：向S7的酶标板中每孔加入50μL终止液，终止反应；

S9.读数：使用酶标仪读取S8中酶标板每孔的OD450值。

9.根据权利要求8所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤S3中，封闭时间为1～2h。

10.根据权利要求8所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述步骤S4中，样品的孵育时间为1～2h。