[发明专利]一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF药物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法，其特征在于，所述细胞穿透肽融合蛋白由细胞穿透肽CPP与VEGF拮抗蛋白融合而成；

所述细胞穿透肽CPP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1=RRRRRR所示；

所述细胞穿透肽CPP的N端连接有FITC荧光基团，为5-FITC-CPP；

所述VEGF拮抗蛋白选自康柏西普或雷珠单抗；

所述制备方法包括以下步骤：将5-FITC-CPP冻干粉溶解于康柏西普或雷珠单抗原液中，之后将溶液置于Vortex旋涡振荡器上，震荡反应，得到的澄清液体经过过滤后，收集到容器中，放入4℃冰箱保存直至使用；

所述康柏西普或雷珠单抗原液的浓度为10mg/ml；

所述细胞穿透肽5-FITC-CPP冻干粉与所述VEGF拮抗蛋白的质量比为1:2；

所述5-FITC-CPP冻干粉的制备过程包括如下具体步骤：

（1）树脂溶涨：

将2-Chlorotrityl Chloride Resinsh树脂放入反应管中，向反应管中加入15mL/g 的DCM，振荡30min；

（2）链接第一个氨基酸：

通过沙芯抽滤掉反应管中溶剂，随后加入3倍摩尔过量的Fmoc-Arg（pbf）-OH精氨酸，利用DMF溶解，再向反应管中加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min，加入用甲醇进行封闭；

（3）脱保护：

抽掉反应管中的DMF，向其中加入20%哌啶DMF溶液15mL/g，反应5min，抽出溶液，再次加入20%哌啶DMF溶液15mL/g，继续反应15min；

（4）检测裸露氨基酸位点：

抽掉反应管中哌啶溶液，加入2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，用乙醇清洗三次，去除乙醇，随后加入Kaiser检测试剂，105℃－110℃加热5min,可观察管中出现深蓝色即为还存在可结合位点；

（5）清洗检测试剂：

去除反应管中的溶液，加入DMF 10mL/g进行清洗，共清洗六次，清洗完成后，抽出DMF；

（6）缩合：

取三倍过量的保护用氨基酸以及三倍过量的HBTU粉末，缓慢加入DMF溶解，DMF量为刚好溶解粉末最佳，随后将溶液加入反应管中，立即加入准备好的十倍过量DIEA，反应30min；

（7）再次检测：

操作同第（4）步，观察反应管中出现蓝色即为还存在可结合位点；

（8）清洗检测试剂：

操作同第（5）步；

（9）重复（3）至（6）步操作，从右到左依次连接序列中的六个精氨酸，最后链接5-FITC，再次进行结合位点检测，未出现蓝色，即为氨基酸结合位点已耗尽，从此步骤开始，后续全部步骤进行避光操作；

（10）抽干管中溶液并清洗树脂：

首先抽干反应管中溶液，随后加入DMF 10mL/g清洗两次，抽出溶液，再次加入甲醇10mL/g清洗两次，去除溶液后继续加入DMF 10mL/g清洗两次，最后加入 DCM 10mL/g清洗两次，利用机器抽干反应管10min；

（11）从树脂上切割多肽：

首先按照比例配制切割液10mL/g：TFA 95%；水1%；EDT 2%；TIS 2%，随后将切割液加入反应管中，切割时间：120min；

（12）吹干切割液并洗涤树脂：

利用氮气使反应管中的切割液进行浓缩，随后向反应管中加入乙醚进行清洗，重复六次，随后常温挥干反应管中树脂；

（13）分析提纯：

利用高效液相色谱对多肽粗品进行提纯，并对目标多肽溶液进行收集；

（14）冻干：

将收集到的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成淡黄色粉末。

2.如权利要求1所述的含有细胞穿透肽融合蛋白的抗VEGF滴眼液的制备方法的应用，其特征在于，所述应用为在制备治疗脉络膜新生血管相关疾病的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疾病为年龄相关性黄斑变性。