[发明专利]端氨基离子液体接枝聚赖氨酸间苯二甲酰胺及合成方法和在细胞低温保存的应用

说明书

本发明涉及端氨基离子液体接枝聚赖氨酸间苯二甲酰胺及合成方法和在细胞低温保存的应用；离子液体接枝聚赖氨酸间苯二甲酰胺结构式如下：其中：x和y与反应体系中的PLP和离子液体(IL‑NH₂)摩尔比有关，通过控制PLP、IL‑NH₂投料摩尔比，得到不同的接枝率产物；n₁和n₂为不同结构离子液体N端的烷基链长度，根据不同结构要求，投入不同烷基链长度的离子液体；本发明中聚合物合成采用溶液缩聚反应，反应方法成熟，步骤简单，操作简便。该聚合物由疏水性主链和侧链羧基组成，随pH变化，其构象发生变化。通过接枝离子液体改善其与细胞膜之间的相互作用，起到稳定细胞膜的作用。在细胞、组织等低温保存方面有较大应用前景。

技术领域

本发明涉及一种接枝端氨基离子液体(IL-NH₂)的聚离子液体的制备，其主链为含有酰胺键的模拟肽结构，侧链接枝含咪唑嗡盐的小分子离子液体。特别是涉及离子液体接枝聚赖氨酸间苯二甲酰胺及合成和在细胞低温保存的应用；该聚合物与具有低温冷冻保护作用的海藻糖在协同添加的情况下，能显著提高细胞的低温冷冻存活率，具有用量少，毒性低，操作简便，易于合成制备的优点。在细胞、组织等低温保存方面有较大应用前景。

背景技术

冷冻保存是采用低温或者超低温来最大限度的抑制细胞、组织和器官新陈代谢和生物活性化学反应，并保护其原有结构和功能完整性及生物活性，从而实现长期维持细胞或生物组织生理功能的一项重要医学技术。因此在临床及科学研究中具有重要的理论研究和实用价值。

目前较多的冷冻保存技术主要是添加冷冻保护剂，之后根据不同细胞和不同保存要求，采取快速(玻璃化)、慢速的冷冻方法。在冷冻保存过程中，原发性低温损伤主要发生在细胞膜，从而进一步影响细胞的代谢与功能。在冷冻过程中会产生水溶液的凝固结冰，从而引起化学、电、热及机械环境的改变，对细胞膜产生损伤，损伤机制大致可以概括为如下几方面：溶质富集导致细胞暴露于浓缩的电解质中，细胞脱水使得膜不稳定，从而产生溶液pH值变化、膜囊泡化等现象；瞬间电场的产生对细胞膜产生损伤；细胞膜相分离、热弹性应力和酶不稳定性造成的损伤；冰晶的产生与细胞膜的相互作用等。

常用的小分子冷冻保护剂主要有DMSO、甘油等，但是由于这部分冷冻保护剂存在保存缺陷，如DMSO会造成DNA的甲基化、甘油在使用前需要复杂繁琐的去除步骤，使得在实际应用中存在较大限制。另一类则是高分子冷冻保护剂，主要分为天然和人工合成，比如抗冻蛋白(肽)、聚吡咯烷酮、聚乙烯醇和羟乙基淀粉等。其特点是无法透过进入细胞内，在细胞外通过氢键作用和玻璃化实现细胞冷冻保护作用，保护细胞膜及其表面蛋白(Tsai S,Chong G,Meng P J,et al.Sugars as supplemental cryoprotectants for marineorganisms[J].Reviews in Aquaculture,2018,82:159-162)。

海藻糖作为一种非还原性，葡萄糖的二聚体(342Da)，于能够承受极端寒冷和干燥环境条件的酵母、线虫甚至昆虫等生物体内被发现，具有良好的生物相容性(Stewart S,HeX M.Intracellular delivery of trehalose for cell banking[J].Langmuir,2019,35(23):7414-7422.)，当其分布于膜两侧时，海藻糖可以通过羟基和生物体内的蛋白质、糖、脂肪等大分子形成氢键，替代正常情况下大分子外层水膜对大分子的作用能起到较好的冷冻保护剂作用。但是由于海藻糖的非膜渗透性，其低温(-80℃或者-196℃)保护作用受到一定限制，无法大规模使用。当前一些聚合物(PP50:PLP-g-L-Phe)和短肽(CPP:细胞穿透肽)通过对细胞膜进行破坏或者膜扰动的方式，尝试载入海藻糖，从而提高胞内海藻糖浓度，但这些聚合物由于其疏水性对膜的扰动作用均有较高的溶血率。这对细胞是不利的，无法保证在海藻糖进入细胞的同时，其他物质是否也会进入胞内或者有胞内物质流出。因此发明了一种对膜无明显破坏作用同时具有较低的溶血率的高分子聚合物，通过这种相互作用，稳定细胞膜，从而与海藻糖起到协同低温冷冻保护的作用。

发明内容