[发明专利]一种产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体

说明书

本发明公开了一种产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明将来源于微生物Lactobacillus reuteri 121的部分序列截断的菊糖蔗糖酶作为亲本，构建了单点突变体酶R425W。R425W显著改变了产物链长，使菊糖蔗糖酶失去合成多糖的能力，大量积累低聚果糖，尤其是蔗果三糖。经反应条件优化，R425W生产蔗果三糖的产量最高可达206g/L。生产条件为pH 6.5的磷酸盐缓冲液，45℃，700g/L的蔗糖，15μg/mL的加酶量，反应时间为36h。这一发现对于工业化制备蔗果三糖，以及菊糖蔗糖酶的工业化应用有重要的研究价值。

技术领域

本发明涉及一种产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

菊糖蔗糖酶(Inulosucrase，EC 2.4.1.10)属于糖苷水解酶GH68家族，以蔗糖为唯一底物，发生水解反应生成葡萄糖和果糖，发生转糖基反应生成低聚果糖和菊糖。低聚果糖和菊糖均是被广泛认可的益生元，对于促进肠道益生菌的增殖具有显著作用。菊糖蔗糖酶在以蔗糖为底物时，果糖基不断转移到延长的菊糖链上，产物体系中含有不同聚合度菊糖。通过控制菊糖链的延伸，使得菊糖蔗糖酶失去合成长链菊糖的能力，对产物链长进行靶向调控，可生产出特定聚合度的低聚果糖。

蔗果三糖是最小的低聚果糖，是由一个果糖分子和一个蔗糖分子通过β-(2,1)或β-(2,6)连接而成的三糖。作为主要的低聚果糖成分，在促进益生菌包括柔嫩梭菌Faecalibacterium prausnitzii，双歧杆菌Bifidobacterium的生长方面显示出比其他聚合度的低聚果糖更显著的效果。蔗果三糖存在于许多植物中，但其含量较低、分离纯化难是制约其工业应用的主要障碍。通过酶促合成和微生物发酵生产蔗果三糖具有促进其生产和工业应用的潜力。

发明内容

技术问题：

目前，低聚果糖的生产主要通过β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26))和内切菊粉酶(EC3.2.1.7)进行。蔗果三糖的含量受不同来源的酶的限制，不能得到稳定的工业化生产工艺。关于菊糖蔗糖酶链长调控的研究，仅能使菊糖蔗糖酶生产不同聚合度的低聚果糖，没有关于用于生产蔗果三糖的研究。

本发明提供一种产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶的突变体酶，这一发现对于工业化制备蔗果三糖有重要的现实意义。

技术方案：

为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Lactobacillus reuteri 121的菊糖蔗糖酶(Lare121-ISase)进行分子改造。

本发明的第一个目的是提供一种菊糖蔗糖酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的菊糖蔗糖酶的基础上，将第425位的精氨酸替换为色氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述菊糖蔗糖酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pET系列载体。

在一种实施方式中，所述载体包括pET-22b(+)。

本发明的第四个目的是提供表达所述菊糖蔗糖酶突变体的基因工程菌。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)为载体。

本发明的第五个目的是提供一种生产蔗果三糖的方法，所述方法是以所述菊糖蔗糖酶突变体或含有所述菊糖蔗糖酶突变体的基因工程菌为催化剂，以蔗糖为底物制备蔗果三糖。