[发明专利]一种用于奶牛产乳热钙浓度检测生物传感器制备及方法

权利要求书

1.一种用于奶牛产乳热钙浓度检测生物传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：

(1)单壁碳纳米管(SWNT)的羧化过程：将单壁碳纳米管放置在浓硝酸和浓硫酸体积比为1:3的混合溶液6小时；用足够的Milli-Q纯化水冲洗SWNT，直至水的pH达到中性；将处理后的SWNT放入真空炉中，并在80℃下加热60分钟；1mg SWNT溶解超声处理均匀的分散到2mL二甲基甲酰胺溶液中。

(2)裸玻碳电极放置在0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉中进行打磨，祛除表面杂质、使表面平整，用去离子水和乙醇清洗超声清洗打磨后的玻碳电极表面；

(3)将抛光的玻碳电极浸入乙醇与3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液配比19:1的混合溶液中30分钟，取出后用足够的超纯水冲洗；

(4)在玻碳电极表面滴涂3μL单壁碳纳米管溶液，在60℃的恒温箱中退火30分钟，然后高纯水冲洗掉表面附着力差的单壁碳纳米管残留物；

(5)在常温条件下，将GCE/SWNT在含有6mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的二甲基甲酰胺溶液中浸泡60min；

(6)在高湿环境下在GCE/SWNT/Pbase表面滴涂5μL Ca_substante溶液放置在4℃环境中8小时；

(7)将修饰后的电极分别浸入0.1mmol/L的乙醇胺和0.1％吐温20溶液中60分钟，使乙醇胺与未反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸结合，Tween20与裸露的单壁碳纳米管结合阻碍待测溶液中杂质的吸附；

(8)将50mmol/L的Cazyme溶液滴涂到处理后的电极，使Cazyme与Ca_substrate相互结合，形成GCE/SWNT/DNAzyme。

2.根据权利要求1所述的一种用于奶牛产乳热钙浓度检测生物传感器的制备，其特征在于：所述电极不限于玻碳电极，且表面修饰不限于单壁碳纳米管，可以是其它导电性好的纳米材料；Ca_substrate固定在电极表面可以通过多种方式，如巯基、氨基、特异性DNA序列；所述Ca_substrate、Cazyme的DNA序列为：

Ca_substrate:NH₂-(CH₂)₆GCGGTAGAAGG/rA/TATCACTGAGCACTGGG/rA/TAAGCGGTAGAACTCACAATGTATAATGCGCGCATTATACATTGTGAGT

Cazyme:TCTACCGCTTTGTTGGAATGGCTCATGCCACACTCTTCAGTGCTCAGTGATTGTTGGAATGGCTCATGCCACACTCTTTTCTACCGC。

3.一种用于奶牛产乳热钙浓度检测生物传感器的检测方法，其特征在于，对权利要求1中的生物传感器测定钙离子，包括以下步骤：

(1)生物传感器在对血清或牛奶样品测量前计算R_ct，用5mmol/L[Fe(CN)₆]^4-/3-和0.1mol/L的KCl浸泡生物传感器阵列，用EIS测量；

(2)将生物传感器覆盖在真实样品中9分钟，然后用足够的水冲洗以去除残留物；

(3)生物传感器在对血清或牛奶样品测量后计算R_ct0，用5mmol/L[Fe(CN)₆]^4-/3-和0.1mol/L的KCl浸泡生物传感器阵列，用EIS测量；

(4)根据R_ct、R_ct0计算相对电阻

其中，R_ct0是GCE/SWNT/DNAzyme检测前在5mmol/L[Fe(CN)₆]^4-/3-和0.1mol/L的KCl混合溶液的电阻，R_ct是GCE/SWNT/DNAzyme检测后在5mmol/L[Fe(CN)₆]^4-/3-和0.1mol/L的KCl混合溶液的电阻。

4.根据权利要求3所述的一种用于奶牛产乳热钙浓度检测生物传感器的检测方法，其特征在于：待测样品溶液pH值会影响钙离子切割GCE/SWNT/DNAzyme表面生物材料的切割速率，影响生物传感器的的相对电阻，为了克服这一不足，将GCE/SWNT/DNAzyme与pH计联合使用构建电化学传感器阵列，对检测数据采用不同的数学模型进行处理。

X矩阵和Y矩阵分别通过以下公式处理：

X＝[1，x₁，x₂，x₁²，x₂²，x₁×x₂]

Y＝log₁₀[C]

其中x₁和x₂分别代表生物传感器GCE/SWNT/DNAzyme检测钙离子的阻抗变化和待测样品溶液中的pH值，C代表钙离子的浓度。