[发明专利]一种检测血管紧张素转换酶的方法及其应用

权利要求书

1.一种检测血管紧张素转换酶的方法，其特征在于：

检测ACE活性时，将ACE在去离子水中稀释成最终浓度从0.5mU/L到60mU/L，每个96孔板中含有ACE 25μL、Cys-Ang(I)-Cys肽40μL，在37℃下孵育，使得Cys-Ang(I)-Cys肽充分水解，然后在96孔板中加入50μL的AuNPs，通过检测Cys-Ang(I)-Cys肽的残留量来放大ACE活性信号，最后在5min内记录AuNPs溶液在400-800nm范围内的紫外可见吸收光谱；

检测ACE活性前需要对AuNPs进行合成，AuNPs的合成方法为：

称取100毫升1mM的氯金酸加入到圆底烧瓶中，通过连续搅拌加热到120℃，然后迅速加入10毫升38.8mM的柠檬酸钠溶液并持续加热，以确保氯金酸完全还原，当溶液由无色变为深红色时意味着AuNPs的形成，移去热源，在室温下冷却得到AuNPs备用。

2.根据权利要求1所述的一种检测血管紧张素转换酶的方法，其特征在于：检测ACE活性前需要利用Cys-Ang(I)-Cys肽诱导AuNPs的聚集，在96孔板中将不同浓度的Cys-Ang(I)-Cys肽加入150μL的去离子水中，然后加入50μL的AuNPs，平衡5分钟后，由于Au-S相互作用，AuNPs溶液发生了不同程度的聚集，随着Cys-Ang(I)-Cys肽浓度的增加，AuNPs溶液的颜色由红色变为蓝色或紫色，然后利用紫外-可见光谱、动态光散射和透射电子显微镜对溶液进行进一步的分析和表征，确定每个96板孔中加入Cys-Ang(I)-Cys肽的浓度为5μM。

3.根据权利要求1所述的一种检测血管紧张素转换酶的方法，其特征在于：检测ACE活性时在37℃下孵育时间为30分钟。

4.根据权利要求1所述的一种检测血管紧张素转换酶的方法，其特征在于：所述ACE合成过程中移去热源冷却后采用聚醚砜膜去除AuNPs中的较大杂质，得到实验所需的AuNPs。

5.根据权利要求2所述的一种检测血管紧张素转换酶的方法，其特征在于：利用Cys-Ang(I)-Cys肽诱导AuNPs的聚集时Cys-Ang(I)-Cys肽的添加量为50μL，确保96板孔中最终体积为250μL，所述96板孔中不同浓度的Cys-Ang(I)-Cys肽的浓度范围为0-1000nM。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种检测血管紧张素转换酶方法的应用，其特征在于：

(一)：检测ACE抑制剂，将40μL的ACE与40μL不同浓度的依那普利、雷米普利混合，在37℃下孵育，然后加入Cys-Ang(I)-Cys肽40μL和去离子水30μL，按照检测ACE活性的方法测试剩余的ACE活性，随后加入50μL的AuNPs作为信号放大工具，采用400-800nm范围内的AuNPs紫外可见吸收光谱进行ACE抑制活性检测；

(二)：筛选ACE抑制肽，采用9种不同的活性肽与30mU/mL的ACE在去离子水中孵育，孵育15分钟后，加入5μM的Cys-Ang(I)-Cys与未失活的ACE在37℃下反应15分钟，然后将50μL的AuNPs加入到150μL的混合物中，以颜色的变化来筛选出具有ACE抑制活性的多肽。

7.根据权利要求6所述的一种检测血管紧张素转换酶方法的应用，其特征在于：所述检测ACE抑制剂时在37℃下孵育时间为20分钟，确保ACE活性被充分抑制。

8.根据权利要求6所述的一种检测血管紧张素转换酶方法的应用，其特征在于：所述筛选ACE抑制肽时具有ACE抑制功能的肽能诱导AuNPs聚集，呈紫色，而无ACE抑制功能的肽不能诱导AuNPs聚集，呈红色；9种不同的活性肽分别为KAFAF、CAAAA、VPP、IPP、RPP、IPA、LEP、LQP和GSH，且9种活性肽的浓度均为15μM。