[发明专利]一种中华鲟F2

说明书

本发明公开了一种中华鲟F₂精子的超低温冷冻保存方法，涉及鲟鱼类精子超低温冷冻保存技术领域，包括亲鱼催产、鲜精采集、鲜精活力检测、测定精子质量、冻存液配制、精液稀释、冷藏平衡、降温入液氮等步骤，本发明根据F₂中华鲟精子特性研发出适用于F₂中华鲟精子超低温冷冻保存相关试剂的具体配方及用量，包括稀释液配方、抗冻剂配方、冻存液配方、冻存液和鲜精稀释比率、抗冻剂终浓度。结合F₂中华鲟精子超低温冷冻保存中的平衡过程与降温方法，即4‑6℃平衡15min，液氮面上10cm处平衡10min，投入‑196℃的液氮，能让精子在液氮中长期保存，解冻后精子活力最高达35％。

技术领域

本发明涉及到鲟鱼类精子超低温冷冻保存方法，保存对象为全人工繁殖并全 淡水养殖的中华鲟子二代(F₂)的精子。

背景技术

精子冷冻保存技术应用已广为人知，在畜牧、水产方面得到了广泛的应用。 用适当的冻存液和冻存方法冷冻精子，可以使生殖周期不同步或存在地理间隔的 品系随时获得精子，实现人工繁殖；对于遗传育种学而言，可以不间断地提供配 子用于研究；同时，冷冻精子也保存了鱼类基因，实现了珍稀特有鱼类遗传种质 资源的长期保存。目前已有200多种鱼类精子获得了成功的冷冻保存，许多鱼类 冷冻精子已经达到了冷冻库及应用的目的。近年来开展的淡水鱼类精子冷冻保存 包括兴国红鲤、圆口铜鱼、大鳞副泥鳅等。鲟鱼的精子冷冻保存，已在杂交鲟、 西伯利亚鲟、中华鲟、达氏鲟、史氏鲟、匙吻鲟和俄罗斯鲟等鲟类中有较多报道， 但冻存激活后精子的活力和受精率难达到鲜精的水平。

中华鲟(Acipenser sinensis)隶属于鲟形目、鲟科、鲟属，是典型的溯河生殖 洄游性鱼类，主要分布于我国东海、黄海和渤海大陆架水域及流入其中的大型河 流中，是我国特有的古老珍稀鱼类，属国家一级水生野生保护动物，被世界自然 保护联盟列为濒危物种。

繁殖量减少的同时，中华鲟精子的质量也有下降趋势。统计1973-1976年、 1982-1984年、1988年、1998-2004年、2005-2006年5个时期野生中华鲟精子 剧烈运动时间分别为248、130、90、103和76s，寿命分别为1 788、1 579、1 205、 923和162s，可见精子的质量在下降。2012-2018年，对74尾性成熟的子一代 中华鲟实施人工催产，精子剧烈运动时间平均49.11±13.38s；寿命在平均220.75 ±56.47s。对比野生中华鲟的精子质量，子一代中华鲟精子快速运动时间和寿命 均有所下降。

为了保护中华鲟，国内采取了诸多保护措施，包括每年的增殖放流、人工繁 殖、异地圈养等，而研究中华鲟精子冷冻保存技术，可为中华鲟的人工繁殖及生 产应用提供技术支撑，对保护中华鲟种质资源具有十分重要的意义。有学者开展 了野生中华鲟精液超低温冷冻保存技术研究。但是中华鲟F₂从出生到性成熟全 程在淡水中养殖，其精子质量与野生中华鲟相比有明显的退化，因此对操作技术 的要求更高，原有的中华鲟精子超低温冷冻保存技术需要进一步改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种中华鲟子二代(F₂)精子的超低温冷冻保存方法， 包括精子采集后适当的保存方法，在最佳稀释液和抗冻剂中进行精子和冻存液混 匀后平衡，最后选择适当的冷冻方法，让精子在液氮中长期保存，解冻后精子活 力最高达35％。

本发明的技术方案如下：一种中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，包括以 下具体步骤：

1)亲鱼催产：B超检查性腺，挑选性腺发育至Ⅳ期、健壮无疾病的中华鲟 F₂雄鱼，称重、根据重量注射促黄体素释放激素后放入暂养池培育；

2)鲜精采集：14-20h后采集精液在4℃冷藏避光保存；

3)鲜精活力检测：测定精子质量，在显微镜下进行观察，选择鲜精平均活 力达80％、快速运动达10秒、寿命达80秒的精子进行冻存；