[发明专利]一段过表达丙酮酸脱氢酶复合物的核糖体位点序列及应用

权利要求书

1.一段如SEQ ID No.1所示的能够过表达丙酮酸脱氢酶复合物的核糖体结合位点序列。

2.如权利要求1所述的序列能够构建过表达克雷伯氏肺炎杆菌来源、由基因lpdA、aceE和aceF编码的丙酮酸脱氢酶复合物的质粒载体，应用上述质粒载体能够降低丙酮酸积累、生长受到抑制的克雷伯氏肺炎杆菌中的丙酮酸含量，从而改善菌体的生长。

3.如权利要求2所述质粒载体方法，其特征在于以下工艺步骤：

1)以克雷伯氏肺炎杆菌基因组为模板，上下游引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3、SEQID NO 4和SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7获得带有酶切位点的基因片段aceE、aceF和lpdA；

2)将基因aceE片段利用SpeⅠ进行酶切，基因aceF片段利用XbaⅠ进行酶切，后利用T4连接酶将两端基因连接在一起得到aceE－aceF片段，利用引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 5将aceE－aceF片段进行扩增；然后将扩增的aceE－aceF片段利用SpeⅠ进行酶切，基因lpdA片段利用XbaⅠ进行酶切，后利用T4连接酶将两段基因连接在一起得到了基因片段aceE－aceF－lpdA，然后利用引物SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 7对aceE－aceF－lpdA片段进行扩增；

3)将因片段aceE－aceF－lpdA利用酶XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切，质粒pETNar利用酶SpeⅠ和HindⅢ进行双酶切，利用T4连进行连接，连接后转化到大肠杆菌DH5α中，进行扩增，然后对质粒进行提取，即可获得过表达丙酮酸脱氢酶复合物的重组质粒；

4)将获得的重组质粒转入丙酮酸积累、生长受到抑制的克雷伯氏肺炎杆菌中培养，即可降低菌体中丙酮酸含量，改善细胞生长。