[发明专利]一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用

权利要求书

1.一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，其特征在于，所述检测的相关基因为意大利蜜蜂蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶的基因，检测的方法为设计一组荧光定量引物进行检测，其引物序列为：

Amel-PCD-QRT-F：CTGTGCAACAAGATAGAG；

Amel-PCD-QRT-R：CATTAACATCGTGAGAAG。

2.根据权利要求1所述的一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

(1)荧光定量引物的设计：采用NCBI预测该基因信息，获得基因序列为SEQ ID NO.7，后对意大利蜜蜂中的蜂王、工蜂、雄蜂中PCD进行扩增，检测得序列为SEQ ID NO.8，以二者共同的部分为模板设计荧光定量引物得：

Amel-PCD-QRT-F：CTGTGCAACAAGATAGAG；

Amel-PCD-QRT-R：CATTAACATCGTGAGAAG；

(2)总RNA的提取：采用任意一种通用的RNA提取方法，从意大利蜜蜂成体中提取总RNA，总RNA序列如SEQ ID NO.9；

(3)cDNA合成：以意大利蜜蜂总RNA为模板合成cDNA，反应体系为20μL；

(4)实时荧光PCR：以上述合成的cDNA为模板，上述步骤(1)中Amel-PCD-QRT-F和Amel-PCD-QRT-R以及β-actin-F和β-actin-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数；

(5)意大利蜜蜂蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶基因相对表达量的计算：实时荧光定量PCR后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，计算意大利蜜蜂工蜂、雄蜂和蜂王PCD基因的表达差。

3.根据权利要求2所述的一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，其特征在于：所述步骤(1)中选用以下引物序列进行PCD基因全长的扩增：

Amel-PCD-like-F：TATGTCGATTCTTACGCG；

Amel-PCD-like-R：TTTTCTTCCATTTTAGCAAT。

4.根据权利要求2所述的一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，其特征在于：所述步骤(4)中β-actin-F的序列为ATGCCAACACTGTCCTTTCTGG；β-actin-R的序列为GACCCACCAATCCATACGGA。

5.根据权利要求2所述的一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，其特征在于：所述操作中每条引物分别配制成浓度为100μM的贮存液，工作浓度为2μM。

6.根据权利要求2所述的一种意大利蜜蜂体色分化相关基因的检测及其应用，其特征在于：所述步骤(5)中采用2^－ΔΔCT法计算PCD基因的相对表达量，并比较差异。