[发明专利]基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物及其应用

权利要求书

1.基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物，其特征在于：包括4对多态性引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1～8所示。

2.根据权利要求1所述的基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物，其特征在于：所述老芒麦mtSSR标记引物采用如下方法得到：

1）、提取老芒麦植物的线粒体DNA，并对提取的线粒体DNA进行纯度、浓度和完整性检测，剔除纯度、浓度、完整性不合格的DNA片段得到合格DNA片段；

2）、使用BluePippin全自动核酸回收仪回收步骤1)得到的合格DNA片段；

3）、利用磁珠对回收的合格DNA片段进行初次纯化处理；

4）、对初次纯化处理的DNA片段进行损伤及末端修复；

5）、再次利用磁珠对修复后的DNA片段进行纯化处理得到目的DNA；

6）、使用SQK-LSK109试剂盒中测序接头将经过步骤5）处理得到的目的DNA片段进行连接得到DNA文库；

7）、使用Qubit对步骤6）得到的DNA文库进行精确定量；

8）、将一定浓度和体积的DNA文库加入到Flow cell中，并将Flow cell转移到OxfordNanopore PromethION测序仪进行实时单分子测序获得线粒体基因组全长，并通过高通量Illumina测序结果对其进行校正，然后使用三代组装软件canu对校正后的三代数据进行拼接，设置基因组大小为5m，correctedErrorRate=0.03，得到contig序列，使用blast v2.6将contig序列比对植物线粒体基因数据库，将比对上线粒体基因的contig作为种子序列，使用原始数据对其进行延伸和环化，得到环状主宰结构，然后使用NextPolish1.3.1用三代数据对组装结果进行校正，再使用pilon软件用二代数据对其进行校正，得到环状的老芒麦线粒体基因组；

9）、利用MISA perl脚本软件搜索老芒麦线粒体基因组中分布的SSR位点，参数设定分别为：单核苷酸重复序列，重复单元≥8；二核苷酸重复序列，重复单元≥5；三核苷酸重复序列，重复单元≥3；四、五、六核苷酸重复序列，重复单元≥3；

10）、利用Primer Premier 5软件按照如下引物设计原则进行mtSSR引物设计并筛选得到所述4对老芒麦mtSSR标记引物，所述引物设计原则如下所示：引物长度范围18-26个碱基；退火温度范围50-60℃；产物长度100-300 bp。

3.根据权利要求1所述的基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物在老芒麦和近缘物种垂穗披碱草野生种质资源群体结构和物种鉴定上的应用。

4.利用权利要求1所述的基于线粒体基因组序列开发的老芒麦mtSSR标记引物进行老芒麦和近缘物种垂穗披碱草野生种质资源群体结构和物种鉴定的方法，包括如下步骤：

A、基因组DNA的提取；首先，收集一定数量的老芒麦和一定数量的垂穗披碱草的幼嫩叶片，放入硅胶进行干燥，并采用CTAB法对植物总DNA进行提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并使用NanoDrop 2000对提取的DNA进行纯度检测以及浓度的定量，最终将每个样品的DNA浓度稀释到20 ng/μL；

B、mtSSR-PCR反应；以步骤A提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQ ID NO.1～8所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；PCR扩增体系共15 μL，包含3 μL模板DNA，0.8 μL上、下游引物，所述上、下游引物的浓度为5 pmol µL^-1，7.5 μL MIX，所述MIX包含10×PCRbuffer、Mg²⁺、dNTPs，0.4 µL Taq酶，所述Taq酶的浓度为2.5 U µL^-1，2.5 µL ddH₂O；

C、电泳检测；将步骤B得到的扩增产物进行多态性检测；并对清晰的条带进行统计，采用有带记为“1”，无带记为“0”的原则；

D、利用STRUCTURE软件构建种质群体结构图。