[发明专利]一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性状早期筛选中的应用

说明书

本发明公开了一种检测绵羊FASN基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性状早期筛选中的应用，包括以下步骤：提取湖羊组织DNA样品、FASN基因突变位点g.5157A＞G和g.9413T＞C的单核苷酸多态性分型；通过对湖羊FASN基因单核苷酸多态性与肌内脂肪含量的关联分析，表明对湖羊FASN基因单核苷酸多态性位点的分型检测可以获得用于湖羊肌内脂肪含量性状早期筛选的分子标记。

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)分子标记的筛选与检测，具体涉及一种将DNA池和改进的多重高温连接酶检测反应(imLDR)技术相结合，检测绵羊脂肪酸合成酶(FASN)基因单核苷酸多态性的方法及其应用。

背景技术

形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记是目前常见的四种遗传标记类型。通过遗传标记可以对基因座在家系中的传递进行追踪，其本身具有可识别性和遗传性。分子标记是DNA水平的遗传变异。单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是基因组中分布较为广泛的遗传标记。SNP可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入、缺失所导致。根据SNP在基因中所处的位置不同可分为编码区SNP和非编码区SNP。其中，位于基因编码区的SNP(coding SNP，cSNP)可以分为同义突变(碱基改变前后基因编码氨基酸相同，不会改变蛋白质的序列，但可能导致翻译效率改变)和非同义突变(碱基改变前后基因编码氨基酸发生改变，从而影响蛋白质的结构和生物学功能)。因此对由编码区核苷酸的突变产生的SNP进行检测和分析对育种工作具有重要意义。

目前，SNPs的检测方法主要有以下几种：DNA测序法、聚合酶链式反应—单链构象多态(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)与DNA测序结合法、等位特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。其中，DNA测序法结果准确，但对仪器设备、人员技术的要求较严格，且检测费用较高；PCR-SSCP存在操作繁琐、耗时长等问题；在SNP位点检测中AS-PCR需针对特定基因位点设计引物，而利用引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术对仪器和人员条件要求较高，目前并未得到普遍应用。

改进的多重高温连接酶检测反应(improved multiple ligase detectionreaction，imLDR)技术，是经由连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)技术改良后的基因分型技术，其成本低、速度快、准确性高、仅一次反应就可同时检测16～30个位点。imLDR进行分型检测的原理是先将目标SNPs位点所在区段采用多重PCR反应在一个体系内进行扩增，产物经外切核酸酶和虾碱酶(Exol/SAP)纯化后作为后续连接酶反应的模板；在一个连接反应中，每个位点包含两个5’端等位基因特异探针以及紧随其后的一条Y端位点的荧光标记的特异探针；连接产物通过ABI3730XL的毛细管电泳区分，原始数据文件用GeneMapper4.1软件分析。相比于LDR技术，imLDR技术提高了准确性和分型的成功率。

肌内脂肪(IMF)主要由磷脂、三酰甘油酯、半磷酸、二磷酸甘油酯、胆固醇和固醇酯以及脂肪酸(fatty acid，FA)组成，其沉积于肌束、肌内外膜，使肌肉表面形成大理石花纹，是肉质评价中重要的表观含量性状。基因、品种、管理和营养都不同程度的影响着IMF沉积。IMF与肉的嫩度、多汁性、香味、大理石花纹评分、眼肌面积大小呈显著正相关，在一定范围内随着IMF含量的增加，肉质口感、嫩度与风味都得到提升。IMF的沉积出现在个体发育的较晚阶段，并晚于机体其他部位脂肪的沉积，其组成与机体其它部位脂肪的组成也有较大的差异。研究表明，IMF含量在4％至5％的羊肉品质最佳，为了改善IMF含量，除了关注品种、性别、年龄、饲料营养成分以外，利用与IMF含量相关的候选基因从遗传方面进行品种改良和选育具有重要研究意义。