[发明专利]一种几丁二糖脱乙酰酶突变体及应用

说明书

本发明涉及一种几丁二糖脱乙酰酶突变体，由极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii的几丁二糖脱乙酰酶的第74位的甘氨酸G突变为丙氨酸A得到。本发明提高了几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活、表达量和催化效率，解决了几丁二糖脱乙酰酶Dac转化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高的问题。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种几丁二糖脱乙酰酶突变体及应用。

背景技术

氨基葡萄糖GlcN又叫葡萄糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，在医疗美容、农业生产、食品保健等领域有着广泛应用。作为形成软骨组织细胞的重要营养素，氨基葡萄糖GlcN在许多国家已被列入医药品行列。几丁二糖脱乙酰酶Dac在生产壳寡糖和单糖方面有着不容忽视的巨大潜力，市场上现存的脱乙酰酶，多是针对乙酰氨基葡萄糖的多聚体或寡聚体发挥作用，而针对单体形式发挥功能的脱乙酰酶鲜有报道。

几丁二糖脱乙酰酶Dac来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii，具有良好的热稳定性和极强的耐热性。刘波等(极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii几丁二糖脱乙酰酶的克隆、表达及性质研究，微生物学报，2006(02)，255-258)指出几丁二糖脱乙酰酶Dac不仅对几丁二糖有活性，对乙酰氨基葡萄糖单体也有很高的催化活性，可以催化几丁二糖的非还原性末端脱去乙酰基，从而生成非还原性末端部分脱乙酰化的GlcN-GlcNAc，然后在外切氨基糖苷酶的作用下生成氨基葡萄糖GlcN和N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc，随后，几丁二糖脱乙酰酶Dac再催化N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc脱乙酰生成氨基葡萄糖GlcN，相较于化学水解法和微生物催化法生产氨基葡萄糖GlcN，酶法催化具有原料来源丰富，且价格低廉，生产工艺简单等优点。

来源于热球菌属的几丁二糖脱乙酰酶Dac可以利用N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为底物进行单酶催化反应，实现氨基葡萄糖GlcN的一步生产。但利用几丁二糖脱乙酰酶Dac转化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高，且酶的活性低，因此，酶的催化效率等酶学特性还有待进一步改进。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过丙氨酸扫描结合高通量筛选，提供了一种几丁二糖脱乙酰酶Dac突变体，提高了几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活、表达量和催化效率，从而解决了几丁二糖脱乙酰酶Dac转化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高的问题。

本发明的第一个目的是提供一种几丁二糖脱乙酰酶突变体，由氨基酸序列如SEQID NO.3所示的几丁二糖脱乙酰酶的第74位的甘氨酸G突变为丙氨酸A得到。

本发明的第二个目的是提供一种编码几丁二糖脱乙酰酶突变体的基因，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种携带上述几丁二糖脱乙酰酶突变体的载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达上述几丁二糖脱乙酰酶突变体的细胞。

进一步地，细胞为枯草芽孢杆菌。

进一步地，枯草芽孢杆菌以B.subtilis WB600为宿主，以p43NMK为表达载体，表达上述几丁二糖脱乙酰酶突变体。

本发明上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：将极端嗜热古菌编码几丁二糖脱乙酰酶的基因与p43NMK载体连接，得到重组表达载体p43NMK-Dac，以p43NMK-Dac为模板，通过PCR扩增的方法将特定序列突变后，将突变质粒转入枯草芽孢杆菌进行筛选，得到重组枯草芽孢杆菌。

本发明利用丙氨酸体积小同时对蛋白质结构影响较小的特性，将几丁二糖脱乙酰酶Dac的关键氨基酸替换成丙氨酸，建立几丁二糖脱乙酰酶Dac的丙氨酸扫描文库，考察不同位点突变时，几丁二糖脱乙酰酶Dac的酶活变化及某些功能的衰退情况，通过表达和筛选过程，从而鉴定某个氨基酸残基在几丁二糖脱乙酰酶Dac的功能和稳定性等方面发挥的重要作用。