[发明专利]一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法，具体包括构建CpPDS‑TRV2重组质粒，转化农杆菌，将TRV1和CpPDS‑TRV2重组质粒的农杆菌菌液混合后注射在山楂果实的赤道处，注射量为90‑110μl。本发明通过将重组质粒注射入山楂果实赤道处构建了山楂果实的瞬时转化体系，不需要遗传转化操作，又可以直接在果实上验证，是验证果实表达相关基因功能的较为理想的方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法。

背景技术

研究基因的功能具有重要的意义。然而，多数果树的稳定转化较为困难，如果涉及果实的表型，耗时估计数年之久，山楂即是如此。因此，果树上基因功能的验证仍需要在模式植物拟南芥、烟草或者番茄‘Mico-Tom’中进行异源稳定过表达。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，可随细胞转录表达和传代，目的蛋白的表达持久、稳定。缺点是由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。

然而在拟南芥和烟草上的异源稳定过表达并不能观测到果实上的表型，而在番茄上的异源稳定过表达虽然能观测果实表型，但是拿到T3代纯合子花费的时间较长，并且由于植株的复杂性和异源性，并不能准确的体现基因的功能。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而丢失，目的蛋白的表达时限短暂。瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。目前，没有发现适用于山楂果实表达相关基因功能的验证方法。

发明内容

本发明提供的一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法，通过将重组质粒注射入山楂果实赤道处构建了山楂果实的瞬时转化体系，不需要遗传转化操作，又可以直接在果实上验证，是验证果实表达相关基因功能的较为理想的方法。

本发明提供一种用于瞬时验证山楂基因功能的方法，包括如下步骤：

S1，扩增标记基因山楂CpPDS片段，将其连接至TRV2载体上，获得CpPDS-TRV2重组质粒；

S2，将TRV1载体和CpPDS-TRV2重组质粒转化农杆菌；

S3，将S2中鉴定为阳性的菌摇培至OD₆₀₀值为0.8-1.2；

S4，将S3中获得的含有TRV1和CpPDS-TRV2重组质粒的农杆菌菌液按照体积比0.9-1.1：1混匀；

S5，在山楂盛花后120天进行注射，注射部位为果实赤道处，注射量为90-110μl。

进一步地，S3中，阳性的菌摇培至OD₆₀₀值为1.0。

进一步地，S4中，将含有TRV1和CpPDS-TRV2重组质粒的农杆菌菌液按照体积比1：1混匀。

进一步地，S5中，所述注射量为100μl。

进一步地，S2中，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明建立了山楂果实的瞬时转化体系，该体系的建立，为山楂基因功能分析和相关的转录调控、蛋白互作等分子生物学的研究，提供了良好的技术支撑。

2、本发明中利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)既不需要遗传转化操作,又可以直接在果实上验证，是验证果实表达相关基因功能的较为理想的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。