[发明专利]一种几丁二糖脱乙酰酶突变体、基因、工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种几丁二糖脱乙酰酶突变体，通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac与底物GlcNAc结合的关键位点进行定点饱和突变体库的构建和筛选，从而鉴定一个或多个氨基酸残基在几丁二糖脱乙酰酶Dac的功能和稳定性等方面发挥的重要作用，并对酶活最高的突变体进行组合突变，获得了几丁二糖脱乙酰酶组合突变体，提高了酶的反应活性。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种几丁二糖脱乙酰酶突变体、基因、工程菌及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖(GlcN)又叫葡萄糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，在医疗美容、农业生产、食品保健等领域有着广泛应用。作为形成软骨组织细胞的重要营养素，GlcN在许多国家已被列入医药品行列。

GlcN通常是由甲壳素和壳聚糖酸水解而成的，从蟹壳和虾壳中提取。但是，这种方法需要在高温和浓酸条件下水解材料，造成严重的环境污染，对设备的需求量较高。因此，以微生物发酵法合成的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为底物生产GlcN已逐渐成为大规模生物生产GlcN的主要方法。然而，从GlcNAc到GlcN的脱乙酰化仍需要酸水解。目前，以GlcNAc为原料，反应条件温和，生物催化法生产GlcN的研究受到广泛的重视。同时也可避免在生产过程中使用酸碱，安全无毒绿色。

几丁二糖脱乙酰酶Dac来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii，具有良好的热稳定性。几丁二糖脱乙酰酶Dac对乙酰氨基葡萄糖单体也有很高的催化活性，能够以GlcNAc为底物进行单酶催化反应，脱乙酰生成GlcN，实现GlcN的一步生产。几丁二糖脱乙酰酶Dac在生产壳寡糖和单糖方面有着不容忽视的巨大潜力。市场上现存的脱乙酰酶多是针对多聚体或寡聚体的乙酰氨基葡萄发挥作用，而针对单体形式发挥功能的脱乙酰酶鲜有报道，且存在利用几丁二糖脱乙酰酶Dac转化合成氨基葡萄糖GlcN效率不高的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过对几丁二糖脱乙酰酶Dac与底物GlcNAc结合的关键位点进行定点饱和突变体库的构建和筛选，并对酶活最高的突变体进行组合突变，获得了几丁二糖脱乙酰酶组合突变体。

本发明的第一个目的是提供一种几丁二糖脱乙酰酶突变体，由氨基酸序列如SEQID NO.1所示的几丁二糖脱乙酰酶突变得到；其中，突变位点为

第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D和第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D和第168位的苯丙氨酸F突变为丙氨酸A；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D和第232位的色氨酸W突变为丙氨酸A；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D、第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E和第168位的苯丙氨酸F突变为丙氨酸A；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D、第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E和第232位的色氨酸W突变为丙氨酸A；

或第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E、第168位的苯丙氨酸F突变为丙氨酸A和第232位的色氨酸W突变为丙氨酸A；

或第74位的甘氨酸G突变为天冬氨酸D、第152位的组氨酸H突变为谷氨酸E、第168位的苯丙氨酸F突变为丙氨酸A和第232位的色氨酸W突变为丙氨酸A。

上述几丁二糖脱乙酰酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

(1)几丁二糖脱乙酰酶经过丙氨酸扫描得到催化关键位点；

(2)根据步骤(1)得到的催化关键位点，构建几丁二糖脱乙酰酶的催化关键位点的所有氨基酸突变体库，筛选出酶活较高的单突变体；