[发明专利]一种PEG修饰鸢尾素类似物及制备方法

权利要求书

1.一种PEG修饰鸢尾素类似物，其特征在于，该类似物具有长效性，该类似物的结构式为：

所述鸢尾素类似物是将鸢尾素59位的半胱氨酸突变成丝氨酸，其氨基酸序列见SEQ IDNO1。

2.根据权利要求1所述的一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)合成鸢尾素类似物重组蛋白基因片段，将重组蛋白基因N端前段加入DDDDK和6个His序列，得到目的基因；

2)运用重组基因技术将目的基因与质粒结合，导入宿主细菌中，筛选得到正确表达宿主细菌；

3)发酵步骤2)所得宿主细菌，正确表达目的融合蛋白后，破碎细菌，得目的蛋白粗产物；

4)纯化步骤3)所得蛋白粗产物得到纯度较高的鸢尾素类似物；

5)使用PEG类似物定点修饰步骤4)所得鸢尾素类似物的N端得PEG修饰鸢尾素类似物；

6)对步骤5)所得PEG修饰鸢尾素类似物进行纯化。

3.根据权利要求2所述的一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的质粒包括pMAL-c5X质粒，所述宿主细菌包括大肠杆菌、毕赤酵母中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述宿主细菌为大肠杆菌B21菌种。

5.根据权利要求2所述的一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)包括：a阴离子色谱柱纯化，b透析酶切，c亲和Ni柱纯化；其中，阴离子色谱柱为Q柱，阴离子Q柱纯化的pH值为7.0-8.0，纯化所使用的洗脱缓冲液的盐包括Tris-Hcl、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、NaAC-HAC中的任意一种；Ni柱纯化pH值为6.5-8.5，Ni柱纯化所使用的洗脱缓冲液的盐包括Tris-Hcl、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、NaAC-HAC及咪唑中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的一种PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述阴离子Q柱纯化的pH值为7.4，所使用的洗脱缓冲液的盐为Tris-Hcl，所述Ni柱纯化pH值为7.5，所使用的洗脱缓冲液的盐为Tris-Hcl及咪唑。

7.根据权利要求2所述的一种长效PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中使用的PEG类似物为聚乙二醇丙酸脂琥珀酰亚胺，分子量为2000-20000，所述PEG类似物定点修饰的位点为鸢尾素类似物的游离-NH₂，反应pH值为：6-8，修饰蛋白浓度为：0.1-5mg/ml，修饰液的缓冲盐为Tris-Hcl、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、NaAC-HAC中的任意一种。

8.根据权利要求7所述的一种长效PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述游离-NH₂为N末端的α-NH₂，反应pH 7.5，修饰蛋白浓度为0.5-1mg/ml，缓冲液盐为NaAC-HAC。

9.根据权利要求2所述的一种长效PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述步骤6)所用纯化方法为反相色谱柱纯化，洗脱缓冲液的盐为Tris-Hcl、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、NaAC-HAC中的任意一种，反相溶剂为乙醇、甲醇、乙腈中的任意一种，反相纯化的pH为6-8，反相纯化上样量为0-20mg/ml。

10.根据权利要求9所述的一种长效PEG修饰鸢尾素类似物的制备方法，其特征在于，所述反相色谱柱为C18色谱柱，洗脱缓冲液的盐为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，反相溶剂为乙腈，反相纯化pH7.5，反相纯化上样量为0-10mg/ml。