[发明专利]诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法

说明书

本发明提供了诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法，具体涉及使用小分子激活剂/抑制剂诱导人多能干细胞分化为肺前体细胞或肺泡细胞的培养基及方法。本发明诱导分化而来的细胞表达典型的肺前体细胞和肺泡细胞生物标志物，其中三维人肺泡类器官具有肺泡样泡状结构，可以作为毒理学研究、药物筛选和肺部疾病研究的材料。

技术领域

本发明属于细胞生物学与发育生物学交叉领域，涉及诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法。

背景技术

肺是人类主要的呼吸器官，其中肺泡上皮细胞组成的肺泡是肺部实现气体交换功能的基本结构和功能单位。在体外培养肺细胞进行药物筛选、毒性测试和疾病研究是临床医学、药学、发育生物学和细胞生物学等领域的共同需求。然而，人源肺泡细胞一直是一种十分稀缺的资源，相关细胞的分离、纯化和实验室扩大培养的技术均不成熟。尽管目前从人胎儿中分离肺上皮前体细胞的实验流程已经比较成熟，但由于肺泡上皮细胞一般出现在孕26周，因此可用于取样的流产胎儿极难获得，亟需一套能够高效获得人体肺泡细胞或肺泡类器官的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，所述方法包括以下步骤：

a.诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞；

b.诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞；

c.诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞；

d.诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞；

e.诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官。

在一些实施方案中，诱导分化使用的基底培养基为LD basal，LD basal配方为：DMEM/F12培养基中加入GlutaMAX(1-4mM，优选为1、2、3、4mM，更优选为2mM)、N2补充剂(1×)，B27补充剂(1×)，抗坏血酸-2-磷酸(40-60μg/mL，优选为40、50、60μg/mL，更优选为50μg/mL)。

在一些实施方案中，诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞所用培养基为LDM-1，所述LDM-1的配方为：LD basal培养基中加入Activin A(20-500ng/mL，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL，更优选为100ng/mL)、CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)。

在一些实施方案中，诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞的诱导时间为1-3天，优选为1、2、3天，更优选为1天。

在一些实施方案中，诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞所用的培养基为LDM-2，所述的LDM-2配方为：LD basal培养基中加入Activin A(20-500ng/mL，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL，更优选为100ng/mL)。

在一些实施方案中，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞所用的培养基为LDM-3，所述LDM-3的配方为：LD basal培养基中加入SB431542(1-20μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μM，更优选为10μM)、dorsomorphin(1-10μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μM，更优选2μM)。

在一些实施方案中，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞的诱导时间为2-4天，优选为2、3、4天，更优选为3天。