[发明专利]一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明涉及一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用，属于发酵工程技术领域。其公开了一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166，已保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为大肠杆菌YC166(Escherichia coli YC166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号CCTCC NO：M2021358。将该菌株应用于酪醇的摇瓶发酵或发酵罐发酵获取。本发明提供的菌株发酵水平与现有技术公开的产酪醇菌株相当，但发酵速度显著高于现有技术的同类型菌株。

技术领域

本发明涉及一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用，属于发酵 工程技术领域。

背景技术

酪醇是一种具有特殊药理作用的酚类有机化合物。酪醇的生产有植物提取、 化学合成和微生物发酵等方法。由于化学合成法成本较低，因此其为目前酪醇 的主要生产方法。

采用微生物发酵法生产酪醇主要以葡萄糖为原料，原料成本低且可再生， 生产过程不易形成有毒物质，是一种有发展前景的酪醇制备方法。现有技术中， 酪醇微生物发酵法的主要缺点是酪醇产量较低和发酵周期较长，已报道的酪醇 发酵方法中产量最高为3.9g/L，发酵时间为48hr(Xu W,Yang C,Xia Y,et al. High-level production oftyrosol with noninduced recombinant Escherichia coli by metabolicengineering.Agricultural and Food Chemistry,2020,68:4616-4623)。

由于使用合适的宿主菌是提高发酵速度的有效方法，因此从自然界中筛选 大肠杆菌，进一步构建产酪醇重组大肠杆菌，最终获得发酵时间显著短于已见 报道的同类菌种的重组大肠杆菌是十分有效的手段。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株缩短发酵周期的产酪醇重组 大肠杆菌及其应用，所述菌株用于酪醇发酵，具有较短的发酵周期。

本发明的技术方案，一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌YC166，已 保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，分类命名为大肠 杆菌YC166(Escherichia coli YC166)，保藏日期2021年4月12日，保藏编号 CCTCC NO：M2021358。

所述产酪醇重组大肠杆菌YC166的构建方法如下：

(1)自然界筛选：首先以大肠杆菌标准株K12为参照，选择菌落与K12 菌株相近的菌落，测序后与MG1655基因序列比较，得到同源性高的197株菌 株；

(2)高生物量宿主菌筛选：将步骤(1)所得197株大肠杆菌培养后制备 为电转化感受态细胞，将重组质粒pKK223-3-ARO10*转入上述大肠杆菌感受态 细胞中，筛选其中能够获得转化子并且转化子具有产酪醇和高菌体浓度特点的 宿主菌YEC039、YEC104和YEC166；

(3)宿主菌改造：对步骤(2)所得高菌体浓度宿主菌YEC039、YEC104 和YEC166进行产酪醇竞争途径基因feaB、pheA、tyrB和芳香族全局调控阻遏 蛋白基因tyrR的敲除，最终得到能够完成敲除工作的宿主菌YEC166，敲除基 因后得到的重组菌YEC166ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔtyrR；

(4)缩短发酵周期的产酪醇重组菌的获得：取步骤(3)获得的大肠杆菌YEC166ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔtyrR再进一步通过电转化转入控制酪醇合成的 关键酶基因ARO10*表达的重组质粒pKK223-3-ARO10*，即获得缩短发酵周期 的产酪醇重组大肠杆菌YEC166ΔfeaBΔpheAΔtyrBΔ tyrR/pKK223-3-ARO10*，该菌株简称为YC166。