[发明专利]一种降低或消除二代测序中扩增产物污染的方法及应用

权利要求书

1.一种降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法，其特征在于：建库过程中先通过重叠多重PCR扩增获得长片段，所述长片段的长度大于一个测序反应；然后将长片段扩增产物片段化为至少两个适合测序的短片段，使片段化后适合测序的短片段不同时含有扩增所述长片段的上游引物和下游引物；

其中，建库过程中通过重叠多重PCR扩增获得长片段的扩增反应体系中含有dUTP，使至少一个dUTP掺入到长片段扩增产物中；所述重叠多重PCR的扩增子依次部分重叠，扩增子与其上游相邻的扩增子和下游相邻的扩增子之间各有50-100bp的重合。

2.如权利要求1所述降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法，其特征在于：对测序样品进行扩增获得长片段的扩增反应体系中含有能够特异性识别含dUTP的核酸的酶。

3.如权利要求2所述降低或消除二代测序过程中扩增产物核酸污染的方法，其特征在于：所述能够特异性识别含dUTP的核酸的酶为1:1的User 酶和FPG酶。

4.一种防止扩增产物核酸污染的二代测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物设计与制备：设计并合成重叠多重PCR引物，使各扩增子长度相当，且扩增子长度大于一个测序反应的长度；

(2)反转录合成cDNA；

(3) 重叠多重PCR扩增：所述重叠多重PCR扩增反应体系中含有dUTP；所述重叠多重PCR的扩增子依次部分重叠，扩增子与其上游相邻的扩增子和下游相邻的扩增子之间各有50-100bp的重合；

(4)扩增产物的纯化；

(5)将扩增产物片段化为适合测序长度的短片段，末端修复，添加dA；所述短片段为至少两个适合测序的短片段，使片段化后适合测序的短片段不同时含有扩增所述长片段的上游引物和下游引物；

(6)连接测序接头；

(7)纯化；

(8)上机测序分析；

所述测序方法出于非诊断目的。

5.如权利要求4所述一种防止扩增产物核酸污染二代测序方法，其特征在于：步骤(1)中设计并合成多重PCR引物，将扩增子长度设定为700-800，Tm值差异在3以内，GC占比40-60％。

6.如权利要求5所述一种防止扩增产物核酸污染二代测序方法，其特征在于：所述多重PCR引物包括SEQ ID NO:1-44和/或SEQ ID NO:45-86。

7.如权利要求4所述一种防止扩增产物核酸污染二代测序方法，其特征在于：步骤(3)中所述多重扩增反应体系中还含有能够特异性识别含dUTP的核酸的酶，所述能够特异性识别含dUTP的核酸的酶为1:1的User 酶和FPG酶。

8.如权利要求4所述一种防止扩增产物核酸污染二代测序方法，其特征在于：步骤(3)中扩增反应体系中含有：反转录cDNA、多重PCR酶预混液、dNTP、多重PCR引物组、User酶、Fpg酶、dUTP和H₂O。

9.如权利要求4所述一种防止扩增产物核酸污染二代测序方法，其特征在于：所述步骤(2)采用随机引物合成cDNA；

所述步骤(4)和步骤(7)采用磁珠纯化；

所述步骤(6)使用T4连接酶和适配Illumina测序的双端index接头；

所述步骤(8)在Illumina平台上机测序。

10.权利要求1-9任一项所述方法在新型冠状病毒2019-nCoV检测中非诊断目的的应用。