[发明专利]基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用

权利要求书

1.一种淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：名称为：6#-7，分类命名为：淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述淀粉酶产色链霉菌通过将脂肪酸合成代谢通路中的关键基因脂肪酸ACP合酶基因fabF在Streptomyces diastatochromogenes 6#-7中分别敲除得到的。

3.根据权利要求1所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述Streptomyces diastatochromogenes 6#-7的名称为6#-7，分类名称为Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；敲除的基因序列分别为fabF1、fabF2、fabF3，基因碱基序列与SEQ No.32、No.33、No.34相似性达90％以上。

4.如权利要求2或3任一项所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

(1)提取原始S.diastatochromogenes 6#-7的基因组；

(2)以步骤(1)提取得到的基因组为模板，采用PCR技术扩增目的基因上下游同源片段；

(3)利用SOE-PCR，将步骤(2)得到的上下游同源片段与用于替换目的基因的抗性片段连接，得到用于敲除目的基因的敲除组件；

(4)将纯化后的融合片段即敲除组件和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16℃条件下，在T4 DNAligase作用下与融合片段进行过夜连接，得到携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒；

(5)将步骤(4)构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，通过接合转移法将所述的表达载体整合入S.diastatochromogenes6#-7的基因组中，获得基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中抗性为安普霉素抗性。

6.根据权利要求4所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒的具体构建步骤如下：

(1)敲除组件的获得：敲除组件包含fabF基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性即安普霉素抗性片段作为筛选标记；

以S.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板，根据fabF基因分别设计上下游同源片段引物序列fabF-F/fabF-R；以pSET 152质粒为模板，根据安普霉素Apr抗性基因设计引物序列apr-F/apr-R；

在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoR I的酶切位点；

(2)重组质粒的构建：将纯化后的融合片段和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16℃条件下，在T4 DNAligase作用下与融合片段进行过夜连接，连接产物通过化学转化的方法转入到E.coli DH5α感受态筛选转化子，保存。

7.根据权利要求4所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中pJTU 412质粒不仅包含来源于大肠杆菌质粒的复制起始位ori COlEI点，也包含来源于链霉菌质粒的复制起始位点ori pIJ101。

8.如权利要求2或3所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在ε-聚赖氨酸制备方面中的应用。