[发明专利]基于单增李斯特菌噬菌体的分离及筛选方法

权利要求书

1.基于单增李斯特菌噬菌体的分离及筛选方法，其根据生猪屠宰场未处理屠宰污水进行噬菌体分离的，其特征在于：该基于单增李斯特菌噬菌体的分离方法，包括以下步骤：

步骤一、准备材料和试剂；

步骤二、进行样品处理；

步骤三、噬菌体的分离及筛选。

2.根据权利要求1所述的基于单增李斯特菌噬菌体的分离及筛选方法，其特征在于：所述步骤一中准备材料和试剂还包括：LB培养基、DNA酶、RNA酶、0.22μm滤膜、SM缓冲液、氯化铯、TSB-YE培养基、DNA提取酚试剂以及PEG8000。

3.根据权利要求1所述的基于单增李斯特菌噬菌体的分离及筛选方法，其特征在于：所述步骤二中进行样品处理包括：

a、用离心管承装污水，暂时存放在有冰袋的恒温采样箱中；

b、12h内带至实验室进行实验，其余样品放置4℃冰箱保存备用；

c、将采集到的样品进行8000rpm/min，20min，4℃低温高速离心；

d、用直径0.22μm滤膜过滤，制成无菌样品滤液备用。

4.根据权利要求1所述的基于单增李斯特菌噬菌体的分离及筛选方法法，其特征在于：所述步骤三中噬菌体的分离及筛选，还包括一下步骤，

a、制备噬菌体原液，备用；

b、稀释噬菌体原液，备用；

c、对稀释噬菌体原液进行孵育成噬菌体-靶菌混合液，备用；

d、将噬菌体-靶菌混合液进行双琼脂平板培养；

e、纯化出单一噬菌体。

5.根据权利要求4所述的基于单增李斯特噬菌体的分离及筛选方法，其特征在于：所述制备噬菌体原液还包括以下步骤：

a1、将分离用的靶菌提前使用TSB-YE培养基进行过夜复苏培养，放置4℃冰箱备用；

a2、取1mL过滤上清液，加入100μL过夜培养靶菌液，再加入无菌CaCl2母液至溶液终浓度为1.25mmol/L，轻微震荡，使其充分混匀后，加入2mL TSB-YE培养基(胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤培养基)；

a3、室温下静置30min后，置于37℃恒温培养箱，静置培养1d；

a4、取共培养物于4℃，10000rpm/min，低温离心30min；

a5、取上清用0.22μm滤膜过滤后，制成噬菌体原液。

6.根据权利要求4所述的基于单增李斯特噬菌体的分离及筛选方法，其特征在于：所述稀释噬菌体原液的过程为:取噬菌体原液100μL进行10倍梯度稀释，一般取10-1、10-3、10-5稀释度稀释液进行双琼脂平板培养分离，根据所得结果噬菌斑数量，可以进行递增或递减选用稀释度。

7.根据权利要求4所述的基于单增李斯特噬菌体的分离及筛选方法，其特征在于：所述孵育成噬菌体-靶菌混合液的过程为：取稀释液100μL与100μL的靶菌培养液(OD600≈0.6)混合，轻微震荡混匀后，放置于37℃恒温培养箱孵育15min。

8.根据权利要求4所述的基于单增李斯特噬菌体的分离及筛选方法，其特征在于：所述双琼脂平板培养还包括：

d1、制备双琼脂平板下层琼脂平板，用含有1.5％(1.5g/100mL)琼脂的TSB-YE培养基约10mL倾倒下层琼脂平板，倾倒后半支起上盖，使平板内不要形成蒸馏水株；

d2、在孵育完成的噬菌体－靶菌混合液中加入5mL 0.7％水琼脂(0.7g/100mL)，混合后进行上层琼脂平板倾倒；

d3、水琼脂温度注意控制在50～55℃之间，避免温度过高使噬菌体以及靶菌失活；

d4、将制好的双层琼脂平板放置在37℃进行过夜培养，隔天进行观察。