[发明专利]一种分离并纯化重组TPH2蛋白的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种分离并纯化重组TPH2蛋白的方法及试剂盒，克服了现有技术中色氨酸羟化酶TPH2的分离纯化步骤复杂的缺陷，该一种分离并纯化重组TPH2蛋白的方法包括：获取含重组TPH2蛋白的溶液，所述重组TPH2蛋白中包括TPH2、链霉亲和素和Flag标签；亲和层析：分别采用Flag磁珠和链霉亲和素磁珠进行亲和层析，获取层析液；采用分子筛对层析液进行层析纯化即可获得TPH2。本发明具有工艺简单，且能保持TPH2蛋白的结构完整性和活性的优点。

技术领域

本发明涉及蛋白分离领域，具体涉及一种分离并纯化重组TPH2蛋白的方法及试剂盒。

背景技术

色氨酸是人体必需氨基酸之一，参与多种生物代谢过程，是激素等生物活性物质的合成前体，在医药、食品行业都扮演着不可缺失的角色。色氨酸经过羟化酶氧化后可形成5-羟基色氨酸(5-HTP)，再经过脱羧反应产生5-羟基色氨(5-HT)。5-HT又名血清素，与肾上腺素、去肾上腺素、组胺等物质一样，都是人体中重要的胺类物质。5-HT在神经和大脑中有大量分布，是褪黑激素合成的前体，在人体中具有减轻忧郁、失眠、食欲不振、体重失调等症状的作用。此外，抑郁症、自闭症、狂躁症、精神分裂疾病和人体肠道应激反应综合征等疾病的发病过程通常与5-HT的合成或代谢途径受损相关。因此，5-HT是一种重要的精神疾病药物。

目前医药行业所用的5-HT主要由加纳籽中提取的5-HTP转化而来，提取方法多为水热法、醇法和超声提取。但随着人类对环境的过渡开发与污染，非洲加纳树的存在也越来越少，对于5-HTP的获取带来重大困难。在随后的产品研发中，研究学者引进了色氨酸羟化酶，希望以色氨酸羟化酶催化色氨酸大量合成5-HTP；而TPH2是人体中活性最高的色氨酸羟化酶，其主要在脑部表达。已有研究结果表明，色氨酸羟化酶TPH2和苯丙氨酸羟化酶等芳香族氨基酸羟化酶类似，主要由N端调节区、催化中心区和C端聚集区组成，在亚铁离子和四氢蝶呤存在下，可催化底物羟基化。

但色氨酸羟化酶TPH2在生物体环境中并不稳定，可溶性较低，尤其是在大肠杆菌基因工程菌中需融合较大助溶蛋白，因此在大肠杆菌中表达后，其纯化过程十分复杂，且产物需要采用酶切的方式进行除杂，导致活性低，需要后续进行复活处理，操作十分复杂。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中色氨酸羟化酶TPH2的分离纯化步骤复杂的缺陷，从而提供一种可以简单分离纯化TPH2的方法，且保证分离出的TPH2能够保持结构完整性和活性。

一种分离纯化重组TPH2蛋白的方法，

获取含重组TPH2蛋白的溶液，所述重组TPH2蛋白中包括TPH2、链霉亲和素和Flag标签；

亲和层析：分别采用Flag磁珠和链霉亲和素磁珠进行亲和层析，获取层析液；

采用分子筛对层析液进行层析纯化即可获得TPH2。

所述获取含重组TPH2蛋白的溶液的过程为：

获得含TPH2-2Streptavidin-3Flag基因片段的重组质粒，将重组质粒转染到293F表达细胞进行重组蛋白表达后，进行细胞破碎处理获得细胞破碎液，该细胞破碎液即为含重组TPH2蛋白的溶液；

优选的，所述细胞破碎处理时采用机械破碎法、反复冻融法或超声波处理法进行细胞破碎，破碎过程中所用的缓冲液为平衡缓冲液；或/和，在使用Flag磁珠和链霉亲和素磁珠之前，先采用平衡缓冲液对Flag磁珠和链霉亲和素磁珠进行保存；

所述平衡缓冲液包括40～50mmol/L的Hepes、100～150mmol/L的NaCl，0.1～0.5mmol/L的FeSO₄，0.5～1mmol/L的EDTA，0.1～0.5mmol/L的L-色氨酸，体积浓度为0.1％～1.0％的吐温20，体积浓度为10％的甘油，0.5～1.0mmol/L的PMSF，并采用HCl调节pH至7.0～7.5。