[发明专利]一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法

权利要求书

1.一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤1：将激化剂与活化因子包被至培养瓶内，保持4度的温度静置，得到激化活化因子；

步骤2：通过密度梯度离心法将人外周血液内的单个核细胞分离出；

步骤3：在步骤1所述激化活化因子包被的培养瓶中添加活化培养基，再将步骤2提取的所述单个核细胞按照2*106/ml的浓度接种于包被有所述激化活化因子的培养瓶中；

步骤4：第二天观察细胞生长状态及培养基颜色变化情况，培养3-4天，将步骤3所述接种于装有包被激活活化因子的细胞转移至空白培养瓶中，并按照1:1的体积比添加扩增培养基A继续培养；

步骤5：培养至5-6天，按照1:1的体积比添加扩增培养基B继续培养；

步骤6：培养至7-8天，将步骤5所得的细胞转移至培养袋中，按照1:1的体积比添加扩增培养基C继续培养，以后，每间隔2-3天，按照1:1的体积比添加扩增培养基C；

步骤7：待培养至15-16天后，收集上述培养袋中激化活化、扩增的NK免疫细胞。

2.如权利要求1所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，步骤1中的激化剂与活化因子需提前一天包被至培养瓶内，保持4度的温度静置12个小时；

所述激活剂为肝素钠、人血白蛋白和重组抗人CD16单克隆抗体的混合溶液。

3.如权利要求2所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，所述肝素钠500U/ml,所述重组抗人CD16单克隆抗体2ug/ml,混合溶液为5ml，使用5ml混合溶液进行培养瓶瓶包被。

4.如权利要求1所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，步骤3中所述活化培养基为空白培养基TAKARA GT-T551；

所述空白培养基TAKARA GT-T551含有CpG-ODN寡聚脱氧核苷酸、重组抗人CD137单克隆抗体、IL-2、IL-12和IL-15的无血清培养基；

其中所述CpG-ODN寡聚脱氧核苷酸6ug/ml,所述重组抗人CD137单克隆抗体10ng/ml,所述IL-2浓度为1000IU/ml，所述IL-12浓度为20ng/ml，所述IL-15浓度为10ng/ml。

5.如权利要求1所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，步骤3中所述单个核细胞的接种浓度为2×106个/ml。

6.如权利要求1所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，步骤4中所述扩增培养基A为空白培养基TAKARA GT-T551；

所述空白培养基TAKARA GT-T551含有IL-2、IL-12和IL-15；

其中所述IL-2浓度为1000IU/ml，所述IL-12浓度为10ng/ml，所述IL-15浓度为20ng/ml。

7.如权利要求1所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，步骤5中所述扩增培养基B为空白培养基TAKARA GT-T551；

空白培养基TAKARA GT-T551含有IL-2、IL-12和IL-15；

其中IL-2浓度为1000IU/ml，IL-12浓度为20ng/ml，IL-15浓度为10ng/ml。

8.如权利要求1所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，步骤6中所述扩增培养基C为空白培养基TAKARA GT-T551；

空白培养基TAKARA GT-T551含有IL-2；

其中IL-2浓度为1000IU/ml。

9.如权利要求1所述的一种体外高效活化、扩增NK免疫细胞方法，其特征在于，步骤3至步骤6中，培养条件为温度为37℃，二氧化碳浓度5.0％。