[发明专利]一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用，其中所述CYP109B2突变体包括：在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第68位、第70位、第84位、第85位、第240位、第241位、第245位、第288位、第291位、第292位、第294位、第387位或第388位中具有至少一个氨基酸突变。本发明从Bacillus sonorensis中发现了一个可对甾体化合物16β位进行羟基化修饰的细胞色素P450单加氧酶CYP109B2，在此基础上对该P450酶的关键活性位点进行突变，构建突变体库，并筛选得到了一系列催化活性显著提高和/或选择性位点发生改变的突变体，这为甾体化合物的定点羟基化修饰和甾体羟基化产物合成提供了新的资源，且催化效率显著提高、生产过程经济环保。

技术领域

本发明属于生物催化酶技术领域，具体涉及一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用。

背景技术

甾体类(激素)化合物通常都具有环戊烷多氢菲的基本母核骨架的生物活性化合物，甾体类激素在生物机体内广泛参与新陈代谢合成，对生物的生命活动起着非常重要的调节作用。而甾体类药物主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，在临床上广泛用于治疗心血管、风湿、炎症、内分泌失调和抗肿瘤等疾病。目前，甾体类药物是市场上仅次于抗生素的第二大类药物。

对甾体化合物的四个环进行化学修饰能赋予甾体类药物更强的生理和药理活性，且不同位置碳原子的化学修饰产物也会表现出不同的药理活性。相比于甾体底物而言，甾体母核上非活泼碳的羟基化修饰不仅能够通过改变甾体药物本身的极性来增强其生理和药理活性，而且还为甾体药物中间体的进一步衍生修饰提供更广阔的改造空间。如通过特异性羟基化修饰可以得到治疗风湿、哮喘和脑水肿的地塞米松(dexamethasone)，具有抗炎特效的氢化可的松(hydrocortisone)，合成避孕药的重要中间体11α-羟基孕酮(11α-hydroxylated progesterone)以及具有增加糖皮质激素活性的功能的16α-羟基化的类固醇(16α-hydroxylated steroids)等等。甾体分子结构的复杂性决定了甾体母核功能化的多样性，将近20个甚至更多的羟基化位点为甾体类化合物的定点修饰带来了巨大挑战。

生物催化法可以选择性地在惰性C-H键之间引入氧原子，实现羟基化甾醇的一步合成，利用生物催化法合成羟基化甾体表现出传统化学合成方法所不具备的选择性高、环境污染小以及反应条件温和等巨大优势，因此日益成为国际公认的合成高附加值化学品最具潜力的方案。细胞色素P450单加氧酶作为已报道的甾体羟基化酶的主体，为甾体药物的绿色合成提供了重要的开发资源，而对细胞色素P450单加氧酶的结构进行改造，实现一系列羟基化甾醇的高效合成，促进甾体类药物工业化生产具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体及其应用，本发明从索诺拉沙漠芽孢杆菌Bacillus sonorensis中发现了一个可以对甾体化合物的16β位进行高效选择性的羟基化修饰的新的细胞色素P450单加氧酶CYP109B2蛋白酶，在此基础上对该蛋白酶的关键活性位点进行突变，构建了突变体库，并筛选得到了一系列催化活性显著提高和/或选择性位点发生改变的多种突变体，这为甾体化合物的定点羟基化修饰和甾体羟基化产物合成提供了新的资源，且催化效率显著提高、生产过程经济环保。

本发明的目的之一在于提供一种细胞色素P450单加氧酶CYP109B2突变体，所述CYP109B2突变体包括：在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第68位、第70位、第84位、第85位、第240位、第241位、第245位、第288位、第291位、第292位、第294位、第387位或第388位中具有至少一个氨基酸突变。