[发明专利]一种快速发展澳洲野生稻特异性分子标记的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，目的是在不对澳洲野生稻全基因组测序的情况下，提供一种快速发展澳洲野生稻特异分子标记的方法。通过比对澳洲野生稻的BAC末端序列与栽培水稻品种序列之间的差异而设计一个特异性分子标记，原理是利用澳洲野生稻与栽培水稻品种序列间的缺失或者插入，在缺失或插入的序列两端设计引物。选取幼嫩的植株叶片，采用CTAB法提取基因组总DNA，根据琼脂糖凝胶电泳的结果验证分子标记是否在澳洲野生稻与所选水稻品种之间具有多态性。利用本发明的方法可以快速准确地鉴别澳洲野生稻与栽培水稻的多态性，且启动成本低、效率高、操作简单而且条带的特异性明显。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速发展澳洲野生稻特异性分子标记的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年首先建立的体外扩增目的基因的技术，该项技术可以在几个小时内将特定的DNA片段扩增数百万倍，因其便捷快速的特点，该技术在现代分子生物学研究中发挥了重要作用。

InDel标记(Insertion/Deletion markers)是根据基因组中的插入缺失位点，设计扩增这些位点的PCR引物。基于PCR技术的InDel标记因其功能强大、效率高、操作简单、成本低等优点被广泛应用于分子标记辅助选择育种、QTL定位以及物种鉴定，并且已经被成功的用于研究标记性状关联和遗传变异。

澳洲野生稻(O.australiensis)广泛分布于澳大利亚北部，是唯一属于EE基因组的水稻，其基因组大小约是普通水稻基因组的三倍大，共有24条染色体。其直链淀粉含量高，糊化粘度低，能抗白背飞虱和褐飞虱，抗白叶枯病和稻瘟病，高抗三化螟，且抗旱、耐热、耐盐，具有许多抵抗生物胁迫与非生物胁迫的优异性状。

而目前关于澳洲野生稻的相关研究较少，且因为其基因组太大，测序成本高，工作量大，耗费时间长，因此还未有关于澳洲野生稻全基因组测序的报道。通过开发出能快速鉴定澳洲野生稻特异性的分子标记，将对发掘和利用澳洲野生稻的有利性状起到重要的推进作用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种在不对澳洲野生稻全基因组测序的情况下，快速发展澳洲野生稻特异分子标记的方法，该方法能够在短时间内大量发展澳洲野生稻的特异分子标记，且结果稳定、操作简单、效率高、启动成本低且条带的特异性明显。

一种澳洲野生稻特异性分子标记引物，引物序列如下：

正向引物序列：5’-CTCCTCTTCCACGACTGCTT-3’；

反向引物序列：5’-GGTTCATCTCGCTCTTCTCC-3’。

一种澳洲野生稻特异性分子标记引物的制备方法，将澳洲野生稻的BAC末端序列与另一已经全基因组测序水稻品种进行序列比对并设计引物，在缺失或插入的序列两端设计引物。

进一步的，所述已经全基因组测序水稻品种为日本晴。

进一步的，提取待检测水稻叶片的总DNA，并以此DNA为模板，利用所设计分子标记对样品进行PCR扩增；PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳来验证分子标记的可利用性。

进一步的，采用CTAB法提取待测种质的幼嫩叶片DNA，所提取的DNA溶解于双蒸水中，4℃保存备用。

进一步的，PCR反应体系为：反应体积为20μL，其中包括：2×Taq Mix buffer 10μL，双蒸水6μL，10μm的引物E5-4 2μL，待测样品DNA 2Ml；PCR反应条件为：95℃4分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。

进一步的，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上检测，用1×TAE作为电泳缓冲液，电泳恒定电压为120V；电泳30min后，在凝胶成像系统下观察并拍摄。