[发明专利]一种靶向甲基孢囊菌的原位荧光杂交探针和试剂盒及应用与原位荧光杂交鉴定方法

说明书

本发明属于微生物技术领域，涉及一种靶向甲基孢囊菌的原位荧光杂交探针和试剂盒及应用与原位荧光杂交鉴定方法。该探针具有以下结构：M‑F，其中，M为特异性识别甲基孢囊菌的核酸，F为荧光基团。利用本发明的探针和检测方法，可以对环境土壤样品进行荧光杂交，快速、准确鉴定是否存在甲基孢囊菌及其含量。原位荧光杂交鉴定较PCR法等假阳性低，且可省去繁琐DNA提取的步骤，方便快捷。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地，涉及一种靶向甲基孢囊菌的原位荧光杂交探针，包含该原位荧光杂交探针的试剂盒，所述原位荧光杂交探针和试剂盒的应用，以及一种甲基孢囊菌的原位荧光杂交鉴定方法。

背景技术

甲基孢囊菌，好氧，以氧为末端电子受体的严格呼吸型。甲烷、甲醇和甲醛是仅知的能源和碳源。本申请的发明人在富含天然气地区土壤中发现该菌占较大的丰度，该菌具有较为健全的甲烷气降解代谢途径。为了能够快速、准确鉴定甲基孢囊菌，亟需对其典型菌株在混合体系中的检测技术进行开发研究。

目前，甲基孢囊菌的常见检测鉴定方法有两种：1、生理生化鉴定，需分离出纯菌后，对微生物生理生化进行定性研究，该方法周期长且对培养物纯度要求较高；2、基因提取后进行16S rRNA测序，该方法仍需获取纯培养物进行全基因提取，再通过通用16S rRNA引物获取保守序列进行测序。

荧光原位杂交技术结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，能够同时提供关于微生物形态、数量、空间分布与细胞环境方面的信息，使人们可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体，并对微生物群落进行评价。目前，荧光原位杂交在微生物系统发育、微生物诊断和环境微生物生态学研究中应用较多，它不仅可以检测微生物的形态、物种多样性，而且还可以分析各物种之间的相对丰度，其与流式细胞术相结合，可进一步增加检测的灵敏性和准确性。关于该技术在土壤油气微生物检测中的应用仍有待研究。

发明内容

本发明的目的是针对富含天然气地区土壤中的甲基孢囊菌进行检测，以进一步确定该菌与天然气富集区域之间的关系。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种靶向甲基孢囊菌(Methylocystis)的原位荧光杂交探针，该探针具有以下结构：M-F，其中，M为特异性识别甲基孢囊菌的核酸，F为荧光基团。

本发明的第二方面提供一种原位荧光检测试剂盒，该试剂盒包括：

1)上述原位荧光杂交探针；

2)多聚甲醛溶液；

3)杂交缓冲液；

4)SSC储存液；

5)DAPI；以及，任选的

6)乙醇溶液，和/或

7)抗淬灭剂。

本发明的第三方面提供上述原位荧光杂交探针和/或上述原位荧光检测试剂盒在甲基孢囊菌原位荧光成像中的应用。

本发明的第四方面提供一种甲基孢囊菌的原位荧光杂交鉴定方法，采用上述试剂盒，包括以下步骤：

(1)用缓冲液洗涤含有甲基孢囊菌的土壤样品；

(2)加入多聚甲醛溶液混匀；

(3)将菌液离心，采用梯度浓度的乙醇溶液重悬菌体，然后风干菌体；

(4)用杂交缓冲液重悬风干后的菌体，加入探针进行杂交；

(5)加入SSC稀释液洗涤并将所得菌液离心；

(6)用SSC稀释液重悬菌体，并加入DAPI进行核酸染色；

(7)对核酸染色结果进行定性或定量分析。