[发明专利]基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒

说明书

本发明公开一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明通过LbaCas12/crRNA系统的单碱基分辨率能力，通过分别设计针对新冠病毒的非突变的靶点N501和突变靶点Y501的501‑crRNA‑W以及501‑crRNA‑M，对样品分子进行检测，只需要一台PCR仪或者恒温装置和简易荧光读取装置，当使用两个crRNA同时检测同一个样品的时候，可快速、有效区分待测核酸样品是非突变株还是突变株，同时具有高特异性、高灵敏度以及低成本的特点，更加广泛适用于各种分子诊断实验室。本发明对新冠病毒疫情防控具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于快速检测新冠病毒 (SARS-CoV-2)和突变株(N501Y突变)的方法及试剂盒，具体是利用 Cas12a/crRNA特异性快速检测SARS-CoV-2和变异株的N501Y突变。

背景技术

随着感染人数增多，SARS-CoV-2突变也逐渐增加累加。N501Y突变是位于 新冠病毒(SARS-CoV-2)S蛋白上的单碱基突变(S基因上1501AT)。N501Y 突变是新冠病毒突变中的一个关键突变，有研究表明N501Y突变提高了病毒进 入细胞的效率，从而增加病毒的传染性。此外，N501Y变异还会降低新冠康复 者血清的中和能力，对于新冠疫情的防控与治疗带来非常大的不稳定性。

目前检测新冠病毒突变的主要方法仍然是通过全基因组测序(WGS)或者 Sanger测序的方法进行，不仅速度慢且不适合所有分子诊断实验室。因此开发 一种快速的、灵敏的、便捷的、低成本的新冠病毒突变N501Y的检测方法及试 剂盒对于本领域疫情防控与治疗、新冠突变株的早期发现具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于 CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病 毒和突变株的方法。该方法是一种利用LbaCas12a/crRNA系统进行新冠病毒和 突变株的N501Y突变的检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的试剂盒，包括LbaCas12a、针对非突变株N501的特异性501-crRNA-W序列、针对突变株Y501 的特异性501-crRNA-M序列、针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物 或RT-PCR引物、报告单链DNA分子；

为了更好的实现本发明，所述试剂盒可结合RT-RAA、RT-RPA等恒温扩增 技术或着逆转录PCR(RT-PCR)技术进行新冠病毒核酸的逆转录以及扩增；

优选的，所述试剂盒还包括A Buffer、NEBuffer2.1、RNase Inhibitor、冻干 RT-RAA反应微球、MgAc。

所述的N501的特异性501-crRNA-W序列如SEQ ID NO：1所示，Y501的 特异性501-crRNA-M序列如SEQ ID NO：2所示，与传统crRNA设计不同，该 序列是通过引入突变并进行筛选后获得的高特异且高灵敏序列。

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-RAA引物为501-RT-RAA-F/R 引物组(SEQ ID NO：3～4)，所述RT-RAA引物是通过新冠病毒高通量序列比 对，分析引物候选区域的突变频率，结合新冠病毒分子流行病学特征及RT-RAA 引物需求筛选出来的高效特异序列；

所述的针对新冠病毒和突变株特征序列的RT-PCR引物为501-RT-PCR-F/R 引物组(SEQ ID NO：5～6)，所述RT-PCR引物是通过新冠病毒高通量序列比 对，分析引物候选区域的突变频率，结合新冠病毒分子流行病学特征及RT-PCR 引物需求筛选出来的高效特异序列；