[发明专利]一种可实现靶基因两种剂量表达的基因修饰模型构建方法

说明书

本发明提供了控制同一靶基因在宿主中以不同剂量进行表达的方法及产品，在插入序列中，外源强启动子两端设置了两个终止元件，每个终止元件两端具有不同的重组酶识别位点序列，当插入到宿主基因组编码外显子之前的内含子之中时，两个终止元件将阻止启动子的功能从而抑制靶基因表达，而通过不同的重组酶控制相应的终止元件及启动子的剔除实现内源启动子或外源强启动子调控的基因低剂量或高剂量表达。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可实现靶基因两种剂量表达的基因修饰模型的构建方法。

背景技术

利用基因过表达制备细胞或者动物模型，是研究基因功能的常用技术，广泛应用于生命科学和医学基础研究以及临床前转化研究。常用的转基因动物模型为研究早期发育、疾病的发病过程和临床前药物评价提供了强有力的工具。研究发现，在这些模型中基因的表达剂量和表型密切相关，如：FUS基因发现与肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）有关，在过表达野生型人FUS基因的转基因纯合子小鼠中（FUS蛋白表达量是对照组的1.9倍），早期出现震颤，随后后肢逐渐瘫痪，12周的时候小鼠死亡；然而在过表达野生型人FUS基因的转基因杂合子小鼠中（FUS蛋白表达量是对照组的1.4倍），没有出现运动障碍的表型或者病理病变。这说明人FUS基因过表达导致进行性神经元病变是剂量依赖的(Jacqueline C. Mitchell et al., Overexpression of human wild-type FUS causesprogressive motor neuron degeneration in an age- and dose-dependent fashion.Acta Neuropathol (2013) 125:273–288, DOI 10.1007/s00401-012-1043-z）。同样的情况也发生在人源TLR8转基因小鼠模型中(Cristiana Guiducci, et.al, RNA recognitionby human TLR8 can lead to autoimmune inflammation, J. Exp. Med. 2013 Vol. 210No. 13 2903-2919),人源TLR8的表达会导致小鼠自身免疫性疾病的发生，小鼠的存活率及表型和人TLR8的表达量呈明显的负相关。

由此可见，不同剂量的基因表达水平，可以使基因展现出不同的生物学功能；不同剂量的表达模型可以为我们理解基因功能提供更全面的线索。而我们目前常用的不同表达剂量模型，通常有：1）杂合子和纯合子动物模型间的基因表达剂量差异，但两种基因型间的基因表达水平差异有限；2）通过传统的随机转基因方式，因为插入位点和基因拷贝数不同，可以获得不同表达水平的动物模型，但因为常规的转基因模型需要复杂的建系过程，从多个品系中筛选出可传代，目的基因表达的动物模型，增加了时间和成本。

鉴于此，通过一种小鼠模型，高效获得两种或者多种不同表达剂量的模型，对于基因生命科学、医学研究具有重要意义，亦有需求，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可实现靶基因高、低两种剂量表达的基因修饰模型构建方法以及用于实施该方法的核酸序列、载体和宿主，利用该方法制备的细胞和动物模型中，可以实现敲入基因分别由内源启动子驱动表达，实现较低水平的转基因表达或由强启动子（如CAG启动子）来驱动目的基因高表达。

根据本发明的一个方面，提供一种用于基因重组表达的核酸序列，其包含：外源强启动子序列和至少一个控制启动子序列功能的调控元件。优选地，所述在所述外源强自动子上游和下游各有一个控制启动子序列功能的调控元件，其能够调控外源强启动子和/或所述核酸序列插入位置的内源启动子的功能。优选地，所述调控序列为终止元件，其两端具有重组酶识别元件。

本发明还提供了包含上述核酸序列的载体、宿主，以及构建所述载体和宿主的方法，所述方法包括讲所述核酸序列引入所述载体以及将所述核酸序列或载体引入所述宿主。