[发明专利]促进间充质干细胞增殖与分化的培养方法及无血清培养基

说明书

本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种促进间充质干细胞增殖与分化的培养方法及无血清培养基。其包括以下成分：人血小板裂解液0.1～3.5％、L‑谷氨酰胺1～3mmol/L、维生素C衍生物5～30μg/mL，基础培养基补足至1L。本发明无血清培养基通过添加了香菇多糖和2‑O‑乙醚抗坏血酸，实现了仅采用较低浓度的血小板裂解液即可满足间充质干细胞在体外连续扩增培养的需求，并且能够很好的维持间充质干细胞增殖高分化的性能，大大地降低了培养成本的同时降低了临床应用的风险。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种促进间充质干细胞增殖与分化的培养方法及无血清培养基。

背景技术

间充质干细胞能够贴附固相表面生长、细胞表面能表达特异性抗原(阳性表达CD29、CD73、CD90、CD105、同时CD34、CD45等均为阴性)，同时具备在体外诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞的潜能。因此，间充质干细胞在促进造血、免疫调节、促进血管新生等方面均能起到重要的调节作用。

间充质干细胞的临床应用必然需要经过细胞的体外培养和扩增，在体外培养体系中，需要提供类似体液环境的条件和细胞生长和增殖必要的养分，故需要添加血清来为细胞生长、增殖提供所需的养分，但是血清培养存在不同批次间的差异、成分复杂等临床应用风险。

目前已有一些无血清间充质干细胞培养基，如任春红、张昕研发的无动物源成分培养基XF/SF-MSCM，其是以DMEM/F12为基础培养基，加入10g/LrHSA、胰蛋白酶抑制剂、NEAA、转铁蛋白、胰岛素、亚硒酸钠、10ng/mLrhEGF、10ng/mLrhbFGF、L-谷氨酰胺、G-SH、氢化考的松、β-巯基乙醇及双抗制成。该无血清培养基可支持脐带间充质干细胞的体外扩增，维持其免疫学表型及分化潜能，提供数量充足的高质量间充质干细胞，但是在原代分离培养中仍然需要采用含有胎牛血清的培养基进行培养，且细胞贴壁的紧密程度显著低于血清组，这也是目前无血清培养基存在的普遍问题^[1]。

鉴于此，人源血小板裂解液在无血清间充质干细胞培养中显示出明显的优势，有学者在分离的原代分离培养到传代扩增培养中全程采用血小板裂解液替代血清，结果发现，全程采用血小板裂解液替代的间充质干细胞仍然具有非常好的形态、细胞表型和分化潜能。血小板裂解液中仍然含有少量的蛋白，使得其安全性虽然比血清可靠，但是仍然具有风险，同时，目前含血小板裂解液的DMEM/F12体系中需要保证血小板裂解液的含量至少在5％以上才能更好的在传代扩增培养中维持间充质干细胞的特性。如中国专利CN111454893A公开了一种无血清间充质干细胞培养基，其包括基础培养基、2～10％的人血小板裂解液及20～100μg/mL人脂质运载蛋白，其中所述人血小板裂解液的含量需要保持在5％以上才能满足间充质干细胞的生长需要；如中国专利CN109402050A公开了一种无血清成分高效间充质干细胞培养液，其包括：10％人血小板裂解液、0.4％青链霉素、2mmol/L长效谷氨酰胺、15ng/ml趋化因子XCL1、25ng/ml趋化因子CCL3、18ng/ml热休克蛋白、26ng/ml端粒酶抑制剂IFN-α2b及基础培养基，其中采用的人血小板裂解液含量高达10％。如果为了降低血小板裂解液应用的临床风险，目前血小板裂解液应用于无血清培养间充质干细胞中的难题是：如何能够使人血小板裂解液在较低的添加浓度的情况下满足间充质干细胞的连续传代扩增培养，并维持干细胞特性。

参考文献1：任春红,张昕.无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究[J].延安大学学报(医学科学版),2015,13(01):1-4.

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有无血清培养基的缺陷和不足，提供一种含低浓度人血小板裂解液的无血清培养基，该无血清培养基能够应用于间充质干细胞的原代分离培养和传代连续培养，且细胞扩增效率与血清培养基无明显差异，多次传代后细胞表型及分化潜能稳定。