[发明专利]一种检测活细胞细胞膜与骨架间应力传递的生物探针

说明书

本发明公开了一种检测活细胞细胞膜与骨架间应力传递的生物探针，其包括FRET荧光蛋白对、蛛丝蛋白Spider fibroin、JTK8蛋白的SH1结构域以及β‑actin五个部分。探针进入活细胞并表达，通过应力检测单元间的FRET效率变化定量检测活细胞内细胞膜与骨架间应力的变化。该生物探针实现了活细胞内细胞膜与骨架间应力传递的可视化检测，具有可动态检测、灵敏度高、时间分辨率高、成本低等特点。

技术领域

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测活细胞细胞膜与骨架间应力传递的生物探针。

背景技术

细胞膜与骨架间的应力传递可能是应力传递机制的第一步，应力信号通过细胞骨架传递到细胞内部，激活细胞内迁移和粘附相关机制。应力信号可能通过这一途径，调控疾病病理过程。细胞膜与骨架间的应力传递是应力传递机制的重要环节，但目前仍缺乏相关研究工具。鉴于此，本发明提出一种基于荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer，FRET)技术，可检测活细胞内细胞膜与骨架间应力传递的生物探针。该探针具有动态检测、灵敏度高、时间分辨率高等优点。

发明内容

本发明提供一种可活细胞内检测细胞膜与骨架间应力传递的新型生物探针，基于FRET技术，运用亚克隆技术制备检测活细胞细胞膜与骨架间应力传递的生物探针。探针在活细胞内表达并定位于目的位置，通过能量转移效率变化定量检测细胞膜与骨架间应力的大小。

细胞膜与骨架间应力传递可视化探针包括FRET荧光蛋白对、蛛丝蛋白(Spiderfibroin)、重组人酪氨酸蛋白激酶(recombinant human tyrosine-proteinkinase,JTK8)的SH 1结构域以及β-肌动蛋白(β-actin)五个部分，运用亚克隆技术对这五个部分的DNA序列进行酶切与连接，将得到的新DNA序列与pcDNA3.1(+)重组构成目的质粒。JTK8蛋白的SH1结构域能将其锚定于脂筏微区，是脂筏与JTK8蛋白的连接点。此外，选取该结构域还排除了JTK8蛋白功能变化对探针工作的干扰。选择β-actin作为羧基端的目的是确保探针能够与细胞骨架系统结合并精准锚定于微丝。

本发明的技术方案：

一种检测活细胞细胞膜与骨架间应力传递的生物探针，其包括应力检测单元以及位于应力检测单元两端的JTK8蛋白的SH1结构域和β-actin蛋白；所述的应力检测单元包括由蛛丝蛋白连接的荧光蛋白对；其中，

所述的蛛丝蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

JTK8蛋白的SH1结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

β-actin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述的荧光蛋白对选自蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein,BFP)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，GFP及其变体(EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)及其变体(mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby)，青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein,CFP)及其变体(mTurquoise2,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和ECFP)和黄色荧光蛋白(yellowfluorescent protein,YFP)及其变体(EYFP,mVenus,mCitrine,sEYFP和YPet)。

在一个优选的实施方案中，所述的荧光蛋白对为增强型绿色荧光蛋白(enhancedcyan fluorescent protein,ECFP)和能量转移黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein for energy transfer,Ypet)。