[发明专利]离心过滤结合荧光染色判定液体菌种细菌污染情况的方法

说明书

本发明公开了一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其具体是以液体菌种培养过程中或培养结束后的培养液作为样品，将其过滤去除菌丝体后进行离心过滤，使细菌富集，再通过CTC染色检测及CFDA染色检测，以判断液体菌种有无发生细菌污染的情况。采用本发明方法可快速、灵敏的检出食用菌液体菌种是否被细菌污染，可确保高纯度液体菌种用于食用菌生产，避免潜在重大栽培风险，有利于促进食用菌产业的健康发展。

技术领域

本发明属于食用菌液体菌种制备技术领域，具体涉及一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法。

背景技术

我国食用菌栽培面积大，栽培种类多，年产量占世界总产量的70%以上，是世界上食用菌的主要生产者。目前食用菌栽培是我国重要的现代农业产业，产值继粮、油、果、菜占第5位。食用菌栽培离不开菌种，通常采用以木屑为主要培养料成分制备的固体菌种作为接种物。固体菌种具有投资少、生产技术要求相对较低等优点，适合小农户、家庭作坊式生产模式，但具有菌种制备周期长、菌种菌龄不一致、接种效率低、菌丝萌发慢、吃料慢、同步性差等缺点。近年来，随着我国食用菌栽培技术以及产业集中度的提高，工厂化栽培模式已逐渐成为主流。食用菌工厂化栽培中，为提高生产效率，液体菌种的使用受到企业青睐。目前，我国大多数金针菇、杏鲍菇栽培企业开始普遍采用液体菌种。

防止杂菌污染是食用菌液体菌种制备的关键，其受多种因素影响，如操作规范性、员工技术水平、生产设备、培养基组成、生产场地环境条件、管理、微生物种类等。与其它种类微生物相比，食用菌液体培养时生长速度较慢，培养时间长，易发生杂菌污染，因而制备高纯度菌种的难度很大。另外一方面，食用菌液体菌种发生低水平细菌污染时，肉眼无法发现，即使采用一些传统检测方法，包括显微镜检、肉汤培养、平板划线法等也不易检测到细菌污染。而生产上食用菌栽培需使用高纯度菌种，即使发生轻微细菌污染也会对食用菌生产带来灾难性影响，造成重大经济损失，对生产构成重大潜在风险，因此，制备高纯度液体菌种至关重要，而这离不开快速、灵敏的细菌污染检测方法。

本发明提供了一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，采用本发明方法进行细菌污染检测，具有灵敏度高、检测时间短、检测结果易观测等优点，有利于促进食用菌液体菌种在栽培中的应用，降低潜在风险，避免经济损失，有利于食用菌产业的健康发展，并为高纯度食用菌液体菌种的制备和应用提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种离心过滤结合荧光染色判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其可快速、灵敏的检出食用菌液体菌种是否被细菌污染，有助于筛选出高纯度液体菌种用于食用菌生产，促进食用菌产业的健康发展。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种离心过滤结合荧光染色快速判定食用菌液体菌种细菌污染情况的方法，其包括如下步骤：

1）培养取样：于液体菌种培养过程中或培养结束后取培养液作为样品，以监测培养过程有无细菌污染发生或栽培应用前液体菌种的纯度；

2）离心过滤：无菌条件下将取到的样品分别用40目无菌铁纱布过滤去除菌丝体，再将过滤液采用离心过滤管进一步离心过滤（8000-10000 rpm离心5-10 min），以使污染细菌富集至过滤管中亲水性的过滤膜（孔径为0.22 μm）上，过滤液的体积应不低于离心过滤管容量的1/5；每份样品平行制备两份富集细菌的过滤膜；

3）CTC染色检测：在其中一份过滤膜上滴入20-50 μL、1 mmol/L的5-氰基-2,3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物（CTC）染液（用PBS缓冲液配制），于37℃下染色60 min，然后采用肉眼进行初步观测，如肉眼可观测到红色或浅黄色，表明液体菌种发生细菌污染，不能用于食用菌栽培；