[发明专利]一种非洲猪瘟PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种非洲猪瘟PCR检测方法，所述检测方法的引物是基于非洲猪瘟病毒p30蛋白序列设计，该序列具有非常好的特异性、敏感性；该检测方法包括以下步骤：1.从样品中提取病毒DNA；2.以提取的DNA为模板，用设计好的引物对进行PCR扩增；3.对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现185bp大小的条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟PCR检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)感染引起的急性、热性、烈性、接触性传染病，猪感染后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％，其传染性强、发病快、致死率高，对生猪养殖危害巨大，是需要高度防范的传染病，是世界动物卫生组织要求法定报告的动物疫病，同时也是《中华人民共和国动物防疫法》规定的一类疫病。

非洲猪瘟病毒是具有囊膜的双链DNA病毒，病毒基因组长度在170-190kb之间，编码大概150-200种蛋白质，ASFV的p30蛋白是一种很重要的结构蛋白，由CP204L基因编码，有很强的免疫原性，能诱导机体产生中和抗体，为病毒的早期蛋白，在感染后4h胞浆内即可检测到。

2018年之前，中国没有非洲猪瘟，此次非洲猪瘟爆发，在我国已形成较大污染面，受其影响，我国生猪、能繁母猪存栏量快速下降，猪肉价格全国普涨，对我国居民的生活质量造成很大影响，PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，ASFV的p30序列保守，针对p30序列设计出具有高度保守引物序列的PCR检测方法，可以更好应对非洲猪瘟变异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟PCR检测方法，该方法针对ASFV p30保守序列，可以检测多种变异非洲猪瘟病毒。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

1.从NCBI上获得非洲猪瘟p30序列，利用NCBI引物设计功能，设计高度保守的引物序列，设计的引物序列为：Primer F:5’-TGCAGGGCAAGGGTATACTG-3’(Seq ID No.1)，R:5’-CCTCTGATGAGGGCTCTTGC-3’(Seq ID No.2)，长度185bp；

2.一种非洲猪瘟病毒PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从样品中提取病毒DNA；

2)以提取的DNA为模板，用设计好的引物对进行PCR扩增；

进一步的，扩增体系如下：10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-startDNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl₂2μl、DNA模板3μl、ddH₂O9.7μl；

进一步的，PCR扩增程序为：95℃5min、(95℃30s、55℃30s、72℃30s)35个循环，72℃10min、4℃∞；

3)对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现185bp大小的条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

本发明的有益效果是：

本发明基于ASFV p30基因的高度保守区域设计引物，该序列具有灵敏度高、特异性好、适用度高的优点。

附图说明

图1特异性检验结果图

图2敏感性检验结果图

图3不同来源非洲猪瘟病毒检测

具体实施方式