[发明专利]烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因及应用

说明书

本发明涉及一种3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因及应用，3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本申请中，通过对特定烟草3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶的初步研究，发现其与烟草叶片中甾醇含量高度相关，在本氏烟草中将该基因沉默，烟草叶片中胆甾醇和豆甾醇含量发生了明显降低，总甾醇含量降低35.4％。基于这一特性，可利用基因工程手段为烟叶品质调控、烟草新品种培育提供一定的应用基础和参考借鉴。

技术领域

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一种烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因及应用。

背景技术

植物甾醇是一类重要的生理活性物质，可以调控植物生长发育，响应多种生物和非生物胁迫。烟草中甾醇类物质约占烟叶质量的0.1％～0.3％。由于甾醇的结构中含有羟基，热解时其母体的菲环结构可形成多环芳烃，有文献报道烟草中的甾醇是卷烟烟气苯并芘的重要前体化合物。烟草中的甾醇类化合物主要有胆甾醇(cholesterol)、豆甾醇(stigmasterol)、菜油甾醇(campasterol)、和β-谷甾醇((β-sitosterol)，其中，豆甾醇、β-谷甾醇含量较高，菜油甾醇含量次之，胆甾醇含量最低。因此，降低烟草成熟叶片中甾醇含量可有效降低卷烟烟气苯并芘含量。

目前植物中甾醇的合成代谢已有研究，但栽培烟草中调控甾醇合成的基因却鲜有报道。烟草中影响甾醇含量的基因功能研究将为烟叶安全性改善、烟草品种遗传改良提供理论支持，对提高我国烟草产品安全性具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因及其应用，以改善烟草中甾醇含量，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定基础。

为实现上述发明目的，本申请采用如下技术方案：

一种烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有1818个碱基，命名为NtHMGCR11。

进一步的，烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由605个氨基酸残基组成。

进一步的，烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

(1)提取基因组，并反转录为cDNA备用；

(2)设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

NtHMGCR11-F：5’-ATGGACGTTCGCCGGCGAC-3’，

NtHMGCR11-R：5’-CAACAGATATATAACAGAAGCGATC-3’。

进一步的，在步骤(1)中提取基因组时，以烟草品种红花大金元叶片为样品。

上述任一项的烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的应用，利用基因沉默技术，通过调节烟草甾醇3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的表达量，来调节控制烟叶中甾醇含量。

进一步的，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体，转化烟草，筛选获得甾醇含量变化的烟草新品种。

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)的技术，干扰烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的表达使其沉默，烟草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因沉默植株中甾醇含量显著下降，进而获得甾醇含量下降的植物新品种。

本发明的有益效果是：