[发明专利]新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用

说明书

本发明涉及一种新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用，属于生物医药领域。所述CoA连接酶为PcAAE1和PcAAE2，氨基酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示，两种酶均具有CoA连接酶的作用，PcAAE2能够催化底物生成广藿香酮合成的前体物质4‑甲基戊酰‑辅酶A，是广藿香酮合成通路中的关键合酶。本发明通过提高PcAAE1或PcAAE2的转录水平或改变其在不同组织中的表达模式，能进一步提高广藿香酮的产量，并在广藿香酮通路解析及酵母生产广藿香酮具有较强的理论基础和广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型短侧链脂肪酸CoA连接酶及其在制备广藿香酮中的应用。

背景技术

广藿香(Pogostemonis Herba)，也称作藿香、山茴香等，是唇形科刺蕊草属植物，多年生芳香草本，株高50～150cm，老茎粗1～1.2cm，叶片对生圆形，叶脉下陷，叶表皱缩，叶两面被柔毛。轮伞花序多花，花期为6～9个月。广藿香植物，原产于印度、马来西亚、越南等东南亚国家，在宋代传入我国，主要在台湾地区、海南，广东、福建等地栽培。广藿香地上部分药用，具有多种药理活性，芳香化浊、开胃止呕、发表解暑等功效。广藿香的应用价值在于它的精油。广藿香精油被广泛用于香水、香料、洗发水、香皂等产品。广藿香精油用于芳香疗法，可以缓解抑郁、压力、镇定神经、控制食欲和提高性欲。广藿香精油除了具有杀虫、抗病原菌、抗真菌性能外，还具有其他一些生物学活性，如抗病毒、抗氧化剂、镇痛、抗炎、抗血小板、抗血栓形成、抗诱变、止吐、抗纤溶和细胞毒素等。

广藿香精油含有大量的次生代谢物，主要化学成分是广藿香醇(Patchoulicalcohol)和广藿香酮(Pogostone)，是广藿香芳香气味的重要来源。广藿香酮是广藿香药材的有效药用成分之一，广藿香酮主要在植物的茎和叶片中合成。研究表明，广藿香酮是广藿香药材抗病原微生物活性的有效成分。

目前广藿香酮的合成通路还未被解析，广藿香酮是由4-甲基-戊酰侧链和4-羟基-6-甲基-2- 吡喃酮核心环两部分构成。据推测，4-甲基-戊酰侧链的前体物质4-甲基-戊酰辅酶A(4MVCoA) 来源于短侧链脂肪酸的延伸。4-甲基-戊酰辅酶A是由酰基激活酶(AAE)超家族成员通过两步机制激活羧酸形成。首先，通过ATP焦磷酸化，将羧酸基团腺苷化，形成酶联的酰基-CoA 中间体，然后AMP被辅酶A基团取代，形成相应的酰基-CoA硫酯。AAE(Acyl-activating enzymes,酰基激活酶)超家族具有12个碱基的保守区域，即AMP连接框，是AAE超家族的典型特征。有研究发现羧酸和其它植物激素能被偶联到AAE家族的碱基上。广藿香酮主要从广藿香植物叶片提取，材料的获取受到广藿香种植地域限制，同时涉及复杂的提取过程和高昂的成本。尽管广藿香酮可以通过化学方法合成，但是产率和成本限制了其在工业和医药行业的大规模应用。因此对广藿香酮代谢途径的解析是解决这种具有重要经济价值和药用价值的次生代谢化合物在工业和医药行业大规模应用需求的有效途径。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种新型短侧链脂肪酸CoA连接酶，本发明的目的之二在于提供短侧链脂肪酸CoA连接酶在制备广藿香酮中的应用，本发明的目的之三在于提供一种同源蛋白，本发明的目的之四在于提供含有PcAAE1或PcAAE2核苷酸序列的重组载体，本发明的目的之五在于提供一种重组蛋白，本发明的目的之六在于提供一种用于制备 4-甲基-戊酰基间苯三酚的重组酵母菌，本发明的目的之七在于提供一种体外制备4-甲基-戊酰辅酶A的方法，本发明的目的之八在于提供一种体外制备异戊酰辅酶A的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、新型短侧链脂肪酸CoA连接酶，所述脂肪酸CoA连接酶为PcAAE1或PcAAE2，所述PcAAE1是去除信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述PcAAE2的氨基酸序列如SEQID NO:12所示，所述PcAAE1和PcAAE2具有短链脂肪酸CoA连接酶活性。